高通量测序技术检测早期自然流产组织染色体非整倍体及拷贝数变异的临床意义

郑芸芸,李 佳,万陕宁,郑 娇,党颖慧,张建芳,杨 红

(空军军医大学西京医院妇产科,西安 710032;*通讯作者,E-mail:yanghongfck@163.com)

自然流产(spontaneous abortion,SA)为妇产科常见疾病,在妊娠中的发生率为10%-15%[1],其中早期流产(孕6-12周)约占80%。自然流产的病因十分复杂,包括胚胎因素、免疫因素、母体因素、环境因素等,而因为胚胎染色体数目异常原因导致的早期流产约占50%[2,3]。发生自然流产时的孕周越短,染色体异常的可能性会越大。目前国内外有关流产组织染色体异常检测的方法有很多,如绒毛培养染色体核型分析、FISH检测技术、染色体微阵列分析及高通量测序技术,极大地提高了流产组织染色体的分辨率和检测成功率。其中高通量测序技术发展迅速,通过对样本进行全基因组快速扫描,检测出染色体小片段的缺失、重复,用于检测染色体拷贝数变异的优势越来越明显,具有高准确性、高通量、高灵敏度、低成本等优势。本研究应用高通量测序技术检测流产胚胎及绒毛组织,评估该技术的应用价值及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2019年1月至2020年8月期间在空军军医大学西京医院妇产科就诊的不明原因早期胚胎停止发育的91例孕妇,年龄22-41岁,平均年龄31岁,平均孕周6-12周,经B超提示胚胎停止发育(无心管搏动)。排除孕期感染及有害物质接触史。自愿要求流产绒毛组织染色体检测者,签署知情同意书。本研究经中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准。

1.2 染色体拷贝数变异检测

根据伦理要求,按照程序采集流产物组织,取3-5 mg组织研磨,将研磨好的组织放入56 ℃水浴锅中消化过夜。通过试剂盒提取基因组DNA,纯化,得到浓度为20 mg/μl的基因组DNA。根据建库流程进行文库构建(gDNA打断,末端修复,末端加“A”,接头连接)。使用PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段。最后将一定量的文库按照等物质的量混合,上机测序。基于染色体拷贝数变异的检测方法,将每个读长的测序碱基与人类基因组参考序列(hg19)进行比对,通过唯一比对的读长数据进行染色体异常分析。

1.3 统计学方法

使用SPSS19.0统计软件进行分析,计数资料的组间比较采用χ2检验,P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体异常的类型与分布情况

共检测胚胎总数91例，检测结果中50例染色体正常，41例染色体异常。检出有非整倍体的染色体有2,8,9,12,13,14,15,16,19,22号染色体,以15,16,22,X为高发。检出CNV中,其中片段≥5 Mb的CNV(5-26 Mb)6例(54.55%),主要有1,2,7,8,19号染色体上的重复/缺失,重复的片段有25.92 Mb和19.38 Mb;缺失的片段有14.82,14.96,19.36,24.32 Mb。片段<5 Mb的CNV(0.18-5 Mb)6例(54.55%),包括1,7,15,X号染色体上的微重复/微缺失,微重复的片段有1.70 Mb,微缺失的片段有0.50,0.64,0.20,0.42,0.18 Mb(见表1)。阳性样本的分布情况见图1。

表1 91例流产组织高通量测序检测结果 (未完待续)

图1 41例阳性样本染色体异常分布情况

2.2 流产样本特征分布情况

所有患者中,发生流产事件主要集中在孕早期(9-10周),不同孕周间的卡方检验得出差异无统计学意义(χ2=7.941,P=0.242)。91例患者中,检出异常者41例,异常率为45.05%;将早期胚胎停育流产样本依据年龄分为4组:25-29岁38例;30-34岁26例;35-40岁19例;>40岁8例。产妇年龄超过35岁,染色体数目异常的发生率更高,但经卡方检验得出差异无统计学意义(χ2=3.885,P=0.274);复发性流产者41例(含连续两次自然流产者25例,连续3次及以上流产者16例),染色体数目异常高于初次流产患者,经卡方检验得出差异无统计学意义(χ2=2.231,P=0.135,见表2)。

表2 不同组别的流产组织染色体异常率比较 例(%)

3 讨论

流产与多种因素有关,比较常见的有产妇生殖系统发育异常、病原微生物感染等,其中最主要原因是胚胎染色体异常[4,5]。孕妇及其家庭的悲伤与焦虑情绪迫切要求进行流产原因的诊断,并指导下一胎的妊娠,所以对妊娠早期流产胚胎进行遗传学诊断,分析是否存在染色体异常,对探讨孕妇在早期发生流产的病因及相应的遗传咨询具有重要的意义。

目前,对于流产胚胎染色体方面的检测,最常用的方法是FISH技术,针对常见的染色体非整倍体(13,16,18,21,22三体及性染色体数目异常),及发现低比例嵌合,具有高效、特异性强等特点[6]。

细菌人工染色体标记-磁珠分离法(BoSsTM)亦是针对流产胚胎染色体数目异常的一种检测方式,可发现所有的非整倍体(除多倍体),具有高通量、快速等特点[7]。

染色体微阵列分析技术(CMA)是对整体基因组拷贝数的单次、高通量、高敏感性、高分辨率的检测[8,9]。可检出所有的染色体非整倍体、多倍体,还有部分三体,对染色体多处重复、缺失及染色体微缺失/微重复综合征能有效检出,能发现>20%的嵌合。相较其他方法有较大优势。

在本研究中我们应用高通量测序技术来检测流产组织的非整倍体和拷贝数变异,此技术具有高灵敏度、高特异度、高准确度,能够对全基因组进行快速扫描[10]。成本相对低廉,具有临床实际应用价值,实验中检出流产组织染色体CNV共91例,检出异常41例,主要高发在8-9周,孕妇年龄30-40岁。阳性样本中,以16,22,XO染色体发生异常几率高,有文献报道T16,T22是常染色体三体中导致习惯性流产最为常见的三体,会引起孕早期胎儿死亡、宫内生长受限、先天性心脏缺损、严重的脏器畸形等症状[11,12]。双重三体较为少见,约占流产胚胎所有核型的0.21%-2.8%[13]。本研究发现1例既有双重三体又有单体的样本,47,XN,+16,+22,-19,7q11.1-q11.23 del 14.96 Mb;及1例2号三体和19单体,46,XN,+2,-19,7q11.1-q11.23 del 14.82 Mb。主要发生原因是双亲之一的配子形成时或妊娠受精卵卵裂时出现染色体不分离。X染色体单体发生率越高越易造成复发性流产,XO综合征,也称特纳综合征(Turner syndrome),患者通常表现为身材矮小、性腺发育不良、胚胎早期停育等[14],并且性染色体单体流产儿多见于年轻孕妇。染色体病发生率与染色体长度及其基因数量有关[15]。

检出CNV 11例,根据检测结果发现CNV的片段中包含了一些临床意义明确的功能性基因。例如1例检测出4号染色体p16.3-p15.31区域有约19.38 Mb的重复,此重复区域包括MKS3,CC2D2A和RPGRIP1L三个基因,这3个基因会引起眼-脑-肝-肾综合征(COACH syndrome),数据库Decipher、UCSC等显示该区域重复的患者可能有智力发育迟缓、小脑发育不良、肺发育不良等临床表现[16]。1例检出15号染色体15q11.2区域有约0.64 Mb的缺失,该区域为致病区域,患者可能有异位肾、宫内生长迟缓、小头畸形等临床表现[17]。2例检出7号染色体7q36.1区域有缺失,包含了剂量敏感基因:KMT2C,经查询ClinGen数据库资源,剂量致病性有充分证据(Haploinsufficiency Score:3)。该区域缺失的患者可能有精神运动发育迟缓、智力障碍多变和轻度畸形等临床表现[18]。

本研究结果显示复发性流产和初次流产的发生率分别为53.7%和38.0%,差异无统计学意义。Grande等[19]复发性流产者的异常率为60%,初次流产者的异常率为68%,差异也无统计学意义,与本研究结果基本一致,表示流产组织核型异常的风险与流产次数无关。随着女性年龄的增长,卵细胞在逐渐地衰老退化,受精卵细胞内的纺锤丝老化,导致功能不全或部分丧失,易导致受精卵在减数或有丝分裂时染色体不分离,从而导致发生染色体数目异常或结构异常。本研究的数据显示年龄≥35岁组的异常发生率高于其他组,表明女方年龄越大,发生染色体异常的几率越大。

综上所述,高通量测序技术应用于检测孕早期流产组织的非整倍体及拷贝数变异具有较高的灵敏度、特异性和检出率高,有明显的技术优势,孕妇年龄越大,染色体非整倍体及拷贝数变异异常更易导致胎儿畸形、胚胎早期停育等。所以对自然流产的夫妇进行染色体异常的检测并进行遗传学病因分析,从而为帮助再次妊娠提供更多的指导,相信随着技术的发展,高通量测序技术必将为早期自然流产病因诊断提供更有意义的指导信息。