Src激酶抑制剂PP2对癫痫持续状态性大鼠脑水肿形成及ERK1/2和P38信号通路的影响

杨子茵,李 宁,黄 军,李佳宇,高安亮

(成都医学院第二附属医院核工业四一六医院神经外科,成都 610051;*通讯作者,E-mail:3034240438@qq.com)

癫痫(epilepsy,EP)是一种临床常见神经系统综合征,大脑皮层神经元神经过度兴奋以及神经元突发性生物电信号导致癫痫发作,持续发作时可导致脑水肿,短暂性损伤大脑功能,并引发患者焦虑、抑郁等心理疾病,其病情进展缓慢,但可反复发作、难以治愈,严重威胁患者身心健康,给其家庭和社会造成沉重负担[1,2]。脑室内出血、脑卒中、缺氧缺血等是EP的主要致病因素[3],酪氨酸激酶Src可通过调控小胶质细胞磷酸酶、张力素同源蛋白的表达及核因子NF-κB的转录活性、核转运参与介导神经元的发生发展[4,5],抑制Src磷酸化激活可改善癫痫模型大鼠临床症状,减轻脑水肿。研究发现,抑制ERK1/2磷酸化可减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓炎症及体内外神经炎症,降低脑缺血再灌注大鼠脑水肿程度,改善神经功能[6-8];EP患者肺组织P38蛋白的磷酸化水平升高,导致神经源性肺水肿[9],这些发现提示ERK1/2和P38信号可能与癫痫诱导的脑水肿有关,但Src激酶抑制剂PP2是否可影响癫痫持续状态性大鼠脑水肿形成及ERK1/2和P38信号通路,目前并不清楚,本文通过建立癫痫大鼠模型,对此进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司,许可证号:SC-XK(沪)20082-005,质量合格证号:2015000504404,SPF级,体质量200-240 g。饲养条件:大鼠自由饮食、饮水,温度25 ℃,明12 h/暗12 h,相对湿度50%,环境整洁、安静且通风良好。

1.2 材料与仪器

Src激酶抑制剂PP2(货号为LM234),上海联迈生物工程有限公司;丙戊酸钠口服溶液(国药准字H20041435),赛诺菲(杭州)制药有限公司;戊四氮(货号为P6500),上海赫果生物科技有限公司;氯化锂(货号为S24112),上海源叶生物科技有限公司;大鼠TNF-α(ab100785)及IL-6 ELISA试剂盒(ab100772)、兔源ERK1/2(ab17942)、p-ERK1/2(ab223500)、P38(ab170099)、p-P38(ab4822)及GAPDH一抗(ab181602)、羊抗兔二抗(ab150077),美国Abcam公司;RIPA裂解液(P0013K)、BCA试剂盒(P0011)、HE染色试剂盒(C0105),上海碧云天公司。轮转切片机、包埋机、烤片机(型号分别为RM2035、EG1160、HI1220),德国Leica公司;倒置显微镜(型号为1X70),日本Olympus公司;低温高速离心机(型号:Centrifuge 5424R),德国Eppendorf股份公司;酶标仪(型号:XElx800),Perkin Elmer公司;蛋白电泳仪、半干转膜仪(型号分别为1659001、Trans-Blot SD),美国Bio-Rad公司;凝胶成像系统(型号为2500),上海天能公司。EEG-4418K型脑电图仪(NIHON KONDEN公司);立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备及分组给药 参照文献[10]制备EP大鼠模型,SD大鼠腹腔注射127 mg/kg的氯化锂,间隔24 h后,腹腔注射35 mg/kg的戊四氮,于30 min后观察大鼠行为,当其出现面肌抽动、肢体阵挛、跌倒等症状时,参照Racine分级[11]评定癫痫发作级别,标准如下:Ⅰ级为面部阵挛;Ⅱ级为颈部肌肉痉挛,甩尾或节律性点头;Ⅲ级为单侧前肢抽搐;Ⅳ级为双前肢抽搐;Ⅴ级为四肢抽搐、跳跃、失去平衡或跌倒等。建模大鼠持续出现Ⅳ级以上癫痫发作表现,表明建模成功,建模63只,成功60只,将其随机分为模型组、PP2低剂量(1 nmol)组、PP2中剂量(2.5 nmol)组、PP2高剂量(5 nmol)组、丙戊酸钠组,每组12只,另取12只SD大鼠腹腔注射等剂量无菌生理盐水,设为对照组。

参照文献[12],在模型制备成功后,腹腔注射300 mg/kg的10%水合氯醛麻醉大鼠,将其头部固定在立体定位仪上,颅顶备皮后消毒,切开皮肤,使用3%双氧水擦拭骨膜使前囟点清晰暴露,于前囟后0.8 mm,矢状缝右侧1.5 mm处用针头钻一小孔,钻透颅骨但不伤及大脑,小心插入一个带微量进样针的套管,深度为1 mm,然后缝合皮肤后消毒。将Src激酶抑制剂PP2溶于DMSO中配制为0.2,0.5,1 nmol/μl的溶液,PP2各剂量组大鼠每天均以微量进样针缓慢注射5 μl,使最终剂量为:PP2低剂量组1 nmol、PP2中剂量组2.5 nmol、PP2高剂量组5 nmol,丙戊酸钠组大鼠给予5 mg/kg丙戊酸钠[13]灌胃治疗,假手术组及模型组大鼠每天以同样方法缓慢注射5 μl DMSO,并以等剂量生理盐水灌胃,持续3 d。期间青霉素抗感染处理。

1.3.2 检测大鼠癫痫发作情况 用药结束24 h后,脑电波(electroencephalogram,EEG)采用脑电图仪记录,纸速30 mm/s、时间0.1 s、频率35 Hz、增益10 μV/mm,连续描记5 min。观察各组大鼠活动情况,记录其一天之中癫痫发作次数及其持续时间。

1.3.3 检测大鼠脑水肿情况及标本收集 大鼠癫痫发作情况检测结束后,尾静脉取血1.5 ml,静置后离心收集上清,即可得到血清,将其储存于-80 ℃备用;将各组大鼠麻醉后处死,解剖取出大脑,各组随机选取6只大鼠的整个大脑称重,即为湿重,将其置于烤箱中烤干,称重即可得干重,计算脑组织含水量即可检测脑水肿情况,公式为:脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。各组剩余6只大鼠的大脑以PBS冲洗干净后,剪取约0.5 g,剪碎后加入蛋白裂解液,以匀浆机制备为匀浆液,离心收集上清,即可得总蛋白样品液,剩余组织以PBS漂洗干净后置于4%多聚甲醛中固定,再以80%,90%,100%浓度的酒精依次脱水、二甲苯透明、石蜡包埋,最后使用切片机做病理切片备用。

1.3.4 检测大鼠皮层神经元病理变化 选取1.3.3中病理切片完整且含有皮质区组织,脱蜡后,以100%,90%,80%浓度的酒精依次浸泡后,经蒸馏水漂洗后,以HE试剂盒进行染色,具体参照说明书的步骤进行,经再次脱水、透明后封片,置于显微镜下观察大鼠皮质神经元病理变化,任选5个视野拍照。

1.3.5 测定大鼠脑皮质区ERK1/2和P38通路相关蛋白表达 将1.3.3中冻存的蛋白样品液置于4 ℃冰箱中冻融,以BCA试剂盒测定其浓度,参照说明书的步骤进行操作,各组取含20 μg总蛋白的样品液进行电泳,使蛋白分离,然后将其转移至硝酸纤维膜上,以5%脱脂奶粉室温封闭2 h后,根据目的蛋白分子量截取条带置于小盒中,经兔源ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38及GAPDH一抗(稀释比分别为1 ∶2 000、1 ∶5 000、1 ∶2 000、1 ∶2 500、1 ∶1 000)于4 ℃条件下孵育过夜后,以TBST漂洗3次,加入羊抗兔二抗(稀释比为1 ∶2 000),置于摇床上,室温孵育2 h,以TBST再次漂洗3次,采用增强化学发光法显色,以凝胶成像仪对蛋白条带进行拍照,然后以Image Lab软件对图像进行分析,得出各组蛋白相对表达量。

1.4 数据分析

2 结果

2.1 PP2对大鼠癫痫发作的影响

对照组大鼠皮层区以基础波α、β波为主,无明显节律性;模型组大鼠出现散在性痫波,多为尖波、棘波、棘慢复合波,大量痫性放电;PP2低、中、高剂量组、丙戊酸钠组均可见到散在的尖波、棘波,而以PP2高剂量组出现的最少(见图1)。与对照组相比,模型组大鼠癫痫发作次数、持续时间升高(P<0.05);与模型组相比,PP2低、中、高剂量组、丙戊酸钠组大鼠癫痫发作次数、持续时间降低,且PP2三组之间呈剂量依赖性变化(P<0.05),PP2高剂量组与丙戊酸钠组相比,差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

图1 各组大鼠脑皮层区EEG情况

表1 各组大鼠发作次数、持续时间

2.2 PP2对大鼠脑水肿的影响

与对照组相比,模型组大鼠脑组织含水量升高(P<0.05);与模型组相比,PP2低、中、高剂量组、丙戊酸钠组大鼠脑组织含水量降低且在不同PP2组间呈剂量依赖性(P<0.05),而PP2高剂量组与丙戊酸钠组相比,差异无统计学意义(P>0.05,见图2)。

与对照组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05;与PP2低剂量组相比,cP<0.05;与PP2中剂量组相比,dP<0.05

2.3 PP2对大鼠神经元的影响

对照组大脑皮质神经元细胞形态规则,排列规律,细胞膜及细胞核完整、清晰,数量较多;模型组大鼠大脑皮质神经元细胞形态不规则,变小皱缩,排列紊乱,细胞膜及细胞核不清晰,细胞较多凋亡,数量减少,出现病理损伤;与模型组相比,PP2低、中、高剂量组、丙戊酸钠组大鼠皮质神经元细胞病理损伤减轻,且随剂量升高减轻程度呈依赖性增强,PP2高剂量组与丙戊酸钠组大鼠皮质神经元细胞病理损伤减轻程度相似(见图3)。

A.对照组;B.模型组;C.PP2低剂量组;D.PP2中剂量组;E.PP2高剂量组;F.丙戊酸钠组

2.4 PP2对大鼠ERK1/2和P38信号通路的影响

与对照组相比,模型组大鼠脑皮层区p-ERK1/2/ERK1/2、p-P38/P38升高(P<0.05);与模型组相比,PP2低、中、高剂量组和丙戊酸钠组大鼠脑皮层区p-ERK1/2/ERK1/2、p-P38/P38降低,且在PP2三组之间降低呈剂量依赖性(P<0.05),PP2高剂量组与丙戊酸钠组相比,差异无统计学意义(P>0.05,见图4)。

与对照组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05;与PP2低剂量组相比,cP<0.05;与PP2中剂量组相比,dP<0.05

3 讨论

EP患者癫痫发作时,咳嗽反射减弱或消失,造成支气管痉挛,引起呼吸衰竭,进而引起脑组织缺血缺氧,使星形胶质细胞及小胶质细胞活化,破坏血脑屏障,导致脑水肿,严重时甚至可危及生命,目前其病死率高达2%,找到安全有效的治疗药物具有重要的社会及临床意义[14-16]。本文对SD大鼠进行腹腔注射氯化锂及戊四氮建立EP模型,结果显示,建模大鼠出现散在性痫波,多为尖波、棘波、棘慢复合波,大量痫性放电,皮质神经元细胞形态不规则,变小皱缩,排列紊乱,细胞膜及细胞核不清晰,细胞较多凋亡,数量减少,出现严重病理损伤,癫痫发作次数及持续时间、脑组织含水量增加,表明腹腔注射氯化锂及戊四氮可使大鼠出现大量痫性放电,同时皮质神经元损伤严重,造成脑水肿,模型建立成功。

Src作为一种酪氨酸蛋白激酶,是激活受体并向胞内传递信号的核心蛋白激酶,广泛参与脑组织中神经元的突触可塑性、神经元的增殖、凋亡等生理过程,在神经炎症的发生发展中起到重要的调控作用,激活Src可上调巨噬细胞炎性蛋白-1α表达,进而促使神经炎症发生及进展[17],通过抑制Src磷酸化激活可降低其下游ERK1/2及P38蛋白磷酸化水平来抑制LPS诱导的小胶质细胞活化[18];P38信号参与癫痫大鼠导致心脏损伤病理过程,上调其磷酸化水平可促使Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达,加重大鼠心肌细胞疾病发生与发展[19],ERK1/2及P38信号与神经元关系密切,可能参与与脑水肿过程。本研究结果显示,以Src激酶抑制剂PP2处理模型大鼠,可减轻皮质神经元病理损伤,降低癫痫发作次数及持续时间、脑组织含水量、脑组织p-ERK1/2/ERK1/2、p-P38/P38且PP2三组之间变化呈剂量依赖性,表明PP2可降低EP大鼠脑组织ERK1/2及P38磷酸化水平,可减轻癫痫发作,缓解脑水肿,保护神经功能,改善其临床症状,揭示抑制ERK1/2和P38信号激活可能是Src激酶抑制剂PP2缓解癫痫持续状态性大鼠脑水肿的作用机制。

综上所述,Src激酶抑制剂PP2可能是通过抑制ERK1/2和P38信号磷酸化激活缓解脑水肿进而缓解癫痫,改善EP大鼠临床症状,但本文未使用ERK1/2、P38信号通路激动剂及抑制剂进行对照验证,关于其药理机制的证据并不充分,还需后续的深入研究。