NEDD8抑制剂MLN4924抑制肝细胞癌恶性表型的研究

邢晓华,袁 晖,赵必星

(福建医科大学孟超肝胆医院,福州 350025;*通讯作者,E-mail:heady@126.com)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)发病率高,死亡率高,是世界范围内第四大恶性肿瘤[1]。目前手术切除是肝癌治疗的首选方式,但预后仍不理想[2,3],因此,寻找新的抗肿瘤药物是目前提高肝癌治疗疗效的首要任务。

神经前体细胞表达发育调控蛋白8(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated-8,NEDD8)是最早发现和研究的类泛素蛋白之一[4],由81个氨基酸组成,与泛素具有59%的一致性和80%的同源性[5,6]。NEDD8与底物蛋白共价结合的过程为NEDD8共价修饰(neddylation),与泛素化修饰过程类似,也被称为类泛素化修饰。neddylation也需要经过活化酶1(enzyme 1,E1)、结合酶2(enzyme 2,E2)和连接酶3(enzyme 3,E3)催化将单个NEDD8分子共价连接到底物分子上,也是单个分子在底物上依次累加的过程[7]。

MLN4924是一种单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)类似物,通过与NEDD8结合抑制结合酶E2与NEDD8的结合,从而抑制了neddylation的发生过程[8-10]。目前,已有研究证实MLN4924在实体恶性肿瘤和血液恶性肿瘤中具有明显的抑癌作用,其作用机制主要是诱导DNA重新复制/损伤、诱导细胞凋亡/死亡/衰老和自噬、抑制血管生成等[11-13]。由于其在临床前研究中具有良好的抗肿瘤功效和可耐受的毒性,MLN4924目前正在几个Ⅰ/Ⅱ期临床试验中进行研究用于肿瘤治疗。但目前对于MLN4924在肝癌中发挥抗肿瘤效果的作用机制尚不明确,有待于进一步研究。

本研究旨在通过检测MLN4924对肝癌细胞增殖、迁移侵袭等恶性表型及相关信号通路的影响,探讨MLN4924抗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

Hep3B细胞购置于美国ATCC。NEDD8抑制剂MLN4924购于美国Selleck公司,CCK-8试剂盒购于Dojundo公司,Transwell小室购于美国Hyclone公司,β-actin,NEDD8,E-cadherin和N-cadherin等抗体购于美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 Hep3B肝癌细胞株由含10%胎牛血清(Gibico,美国)的培养基,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞密度达到80%时,0.25%胰酶消化,接种至传代继续培养。当细胞密度达到80%时,将细胞分为3组。MLN4924组使用1 μmol/L的NEDD8的抑制剂MLN4924处理细胞,阴性对照组使用等体积的DMSO处理,空白组不作任何处理,4 h后用预冷的PBS缓冲液清洗,加入RIPA细胞裂解液,用细胞刮刀快速刮下,吸入1.5 ml EP管,置于冰上。

1.2.2 蛋白提取及定量 将EP管置于超声破碎仪中15 ℃功率30%超声1 s,停止5 s超声破碎8 min,全程细胞置于冰上,4 ℃,17 000g离心10 min,弃沉淀,将上清转入新1.5 ml EP管;加入1 mol/L二硫苏糖醇(DTT)至其终浓度为8 mmol/L,放入干式恒温器55 ℃加热30 min。冷却后加入500 mmol/L碘乙酰胺(IAA)至其终浓度为50 mmol/L,放入抽屉室温黑暗反应30 min,17 000g离心10 min,取上清备用。BCA法测定蛋白浓度后用于后续Western blot检测。

1.2.3 Western blot检测NEDD8表达,neddylation水平,以及E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达水平 将上述提取的MLN4924组和阴性对照组细胞蛋白样品用上样缓冲液稀释,17 000g离心10 min,取上清进行8%SDS-PAGE电泳;100 V恒压冰浴转印1 h至NC膜,5%BSA封闭4 h后孵育一抗(β-actin,NEDD8,E-cadherin和N-cadherin)4 ℃过夜;次日用TBST缓冲液清洗后孵育相应二抗,室温反应1 h,TBST缓冲液清洗后进行ECL显色,并在凝胶成像分析系统中曝光显影。

1.2.4 CCK-8实验检测肝癌细胞的增殖能力 制备2×105个/ml的细胞悬液,分别加入1 μmol/L的NEDD8抑制剂MLN4924和等体积的DMSO处理作为实验组和对照组,取100 μl接种于96孔板,每株细胞设置10个复孔;需测定细胞增殖情况时,加入10 μl CCK-8试剂,继续培养2 h后用酶标仪检测450 nm处的吸光值;种板后8 h开始测,并记为0 d,随后分别测定1,2,3,4 d的吸光度;评估细胞增殖能力。

1.2.5 Transwell实验检测肝癌细胞的迁移和侵袭能力 细胞消化后用PBS清洗,离心后用不含血清的DMEM培养基重悬,调整细胞密度为1×105个/ml进行处理。迁移实验用含基质胶的小室,加入200 μl处理的细胞至Transwell上室,下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM,放入24孔板于5% CO2、37 ℃培养箱中24 h;用预冷的4%多聚甲醛固定液固定,PBS清洗后用结晶紫染色,双蒸水清洗数次后倒扣自然风干,然后在显微镜下每组随机选择5个视野进行拍照和细胞计数。侵袭实验用含基质胶的小室进行,其余步骤与侵袭实验相同。

1.2.6 细胞划痕实验检测肝癌细胞的迁移能力 细胞划痕实验参照ibidi Culture-Inserts说明书给定的步骤进行。首先制备5×105个/ml的细胞悬液,在Culture-Inserts每一小格加入细胞悬液70 μl,5%CO2、37 ℃培养过夜;在Culture-Inserts外围加200 μl培养基,培养24 h。用无菌镊子夹着Culture-Inserts一角,轻轻移除,再用预热PBS轻轻润洗,加入2 ml不含血清的培养基,培养基中分别含1 μmol/L的NEDD8的抑制剂MLN4924和等体积的DMSO;在0,12,24 h于显微镜下拍照,以拔除Culture-Inserts记为0 h。

1.2.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析及作图,结果用平均数±标准差表示,两组间比较采用t检验,P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MLN4924抑制肝癌细胞neddylation过程

Western blot结果显示,与阴性对照组相比,MLN4924组中NEDD8本体含量增加,而neddylation,即NEDD8经共价修饰后分子量增加的部分减少(见图1),说明MLN4924能抑制肝癌细胞neddylation的发生。

图1 MLN4924对NEDD8蛋白表达及neddylation水平的影响

2.2 MLN4924抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型

与阴性对照组相比,MLN4924组中肝癌细胞的增殖能力受到抑制,两组比较差异有统计学意义(P<0.000 1,见图2)。Transwell细胞迁移验结果显示,MLN4924组中Hep3B细胞在Transwell小室中的迁移数量为176.00±13.60;而阴性对照组中迁移细胞数量为280.80±10.64,两组比较差异有统计学意义(P<0.000 1,见图2)。

与阴性对照比较，****P<0.000 1

细胞侵袭实验结果显示,MLN4924组Hep3B细胞的穿膜数量为101.80±12.66,而阴性对照组穿膜细胞数量为206.40±21.33,两组比较差异有统计学意义(P<0.000 1,见图3)。以上结果表明,MLN4924能显著抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。同时,利用细胞划痕实验进一步检测MLN4924对肝癌细胞迁移的影响,结果显示:MLN4924组在划痕后24 h肝癌细胞迁移率分别为(56.6±1.6)%,而阴性对照组的细胞迁移率为(64.8±2.3)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.01,见图4)。以上结果进一步证实了MLN4924对肝癌细胞迁移能力具有明显的抑制作用。

与阴性对照比较，****P<0.000 1

图4 划痕实验检测MLN4924对细胞迁移的影响

2.3 MLN4924抑制肝癌细胞EMT发生

与空白对照组相比,阴性对照组的细胞形态无明显变化,均呈纺锤状成纤维细胞形态,有伪足;而MLN4924组细胞形态发生比较明显改变,细胞伪足消失,细胞缩小变圆呈上皮细胞形态,黏附性变低(见图5)。结果提示MLN4924处理可能抑制了肝癌细胞的上皮间质转化(EMT)过程。为了进一步验证MLN4924对肝癌细胞EMT信号通路的作用,利用Western blot方法在蛋白水平直接检测肝癌细胞的EMT相关的表型标志物N-cadherin和E-cadherin的蛋白表达水平。结果显示,与对照组相比,MLN4924组的的间质标志物N-cadherin的表达降低,同时上皮标志物E-cadherin的表达升高(见图6)。以上结果证实了MLN4924可抑制肝癌细胞的EMT转换。

图5 MLN4924对细胞形态的影响

与阴性对照比较，*P<0.05，***P<0.001

3 讨论

FDA批准的第一个抑制泛素-蛋白酶体过程的药物是硼替佐米,通过结合蛋白酶体抑制NF-κB信号通路从而杀伤细胞[14],目前已经推荐为套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的一线化疗药物[15,16]。但是目前硼替佐米依然存在比较大的比较普遍的不良反应,包括腹泻、心功能损害等[17]。而MLN4924是特异性的NAE抑制剂,可以通过抑制neddylation过程中的NAE酶而抑制NEDD8激活,从而使主要底物Cullin家族蛋白不能被活化,因此可以起到和硼替佐米相同的效果。目前已有关于MLN4924在各种肿瘤的作用及相关机制的研究,MLN4924可以通过抑制UBE2M抑制肾癌细胞增殖,并且抑制其迁移侵袭[9]。也可以抑制胃癌细胞的增殖与迁移[18]。而在肝癌中虽有报道其可以通过促进肝癌保护性自噬促进肝癌细胞凋亡[19,20],但其对肝癌细胞侵袭转移的详细机制研究目前尚不清楚,有待于进一步研究。

在本文中,我们发现肝癌细胞株Hep3B经MLN4924处理之后,NEDD8的本体增加,而细胞内特异性类泛素化neddylation广泛地受到抑制,由此证明MLN4924可以直接抑制NEDD8的功能。而之后的实验结果证实,MLN4924抑制肝癌细胞的增殖,这与报道的一致。另外,我们还证实了MLN4924也可以明显抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。而后我们观察到在MLN4924的影响下,肝癌细胞形态明显发生改变,由原有的伪足形成且纺锤状成纤维细胞形态缩小变圆,呈上皮细胞形态,且伪足消失。证明肝癌细胞的黏附性降低,由此推测MLN4924可能抑制了肝癌细胞的上皮间质转化(EMT)过程。而后我们检测了MLN4924处理后肝癌细胞中EMT相关分子标志物的表达变化,发现E-cadherin分子表达明显上升,而N-cadherin分子表达明显下降,说明NEDD8确实可以通过提高细胞E-cadherin表达来促进肝癌细胞的EMT。

本研究证实MLN4924可以显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性表型。并且MLN4924处理后的肝癌细胞的黏附性降低。并且进一步证明了MLN4924可抑制EMT信号通路。但是肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的过程,机制错综复杂,具体的内在机制需要我们进一步的深入研究。