清热养阴丸质量标准研究

李月平 龚艳

摘  要：目的 建立清热养阴丸的质量标准。方法 运用薄层色谱法对清热养阴丸中牡丹皮进行定性分析;运用高效液相色谱法对清热养阴丸中黄连的有效成分盐酸小檗碱进行定量分析。结果 在薄层鉴别中三批清热养阴丸色谱与丹皮酚对照品色谱在相应的位置上，显相同颜色的斑点;盐酸小檗碱在0.0708μg～0.7080μg范围内，线性关系良好（R=1），平均回收可达99.6%，相对标准偏差为0.3%，检出限为1.8ng。结论 经实验结果表明，所选薄层色谱与高效液相色谱条件合理，方法简便易行，专属性强，分离度良好。

关键词：清热养阴丸;质量标准;丹皮酚;盐酸小檗碱;高效液相色谱

分类号：R286

引 言

清热养阴丸收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第二册，处方由石膏（60g）、栀子（60g）、黄连（45g）、牡丹皮（60g）、白芍（60g）、地黄（150g）、麦冬（75g）、玄参（120g）、浙贝母（75g）、薄荷（45g）、山豆根（75g）、甘草（45g）以上十二味药进行粉碎成细粉，混匀，每100g加炼蜜90～110g制成大蜜丸，即得。由于清热养阴丸原质量标准中只针对其性状及显微进行鉴别，并没有薄层色谱鉴别及主要成分的含量测定，所以本次研究建立了清热养阴丸中牡丹皮的TLC鉴别，同时建立了黄连的含量测定方法，以便能够更加全面的控制药品的质量，同时对药品的生产及检验工作也具有重要的意义。

一、 试验方法与结果

1、 实验材料

（1） 实验仪器  岛津SPD-M20A液相色谱仪（岛津企业管理（中国）有限公司）、色谱柱 Agilent ZQRBAX-SB-C18 （4.6×250mm，5μm）、超声波清洗机 SB-5200 DTDN（宁波新芝生物科技股份有限公司）、羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板（自制）、万分之一天平 AL204和十万分之一天平 XP205（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、电热鼓风干燥箱  GZX-9076 MBE （上海博迅实业有限公司医疗设备厂 ）

（2）实验样品与试剂

（一） 实验样品  北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂（批号：15013071、0013566、0012103）

（二） 实验试剂与试药  试剂：甲醇、甲苯、乙醚、乙酸乙酯、环己烷、盐酸、硫酸、冰醋酸、乙醇（分析纯 重庆川东化工有限公司）、乙腈（色谱纯 德国默克公司）; 试药：三氯化铁、磷酸二氢钾（分析纯 重庆博龙科技有限公司）、 十二烷基硫酸钠（化学纯 成都市科龙化工试剂厂）;对照品：丹皮酚对照品（批号110708-200506）、盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212，含量为86.7%）均由中国食品药品检定研究院提供

2 、 牡丹皮定性研究

（1）  供试品溶液制备  取样品6g，剪碎，加乙醚10ml，密塞，振摇10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮2ml使溶解，即得[1]。

（2） 对照品溶液制备  取丹皮酚对照品适量，加丙酮制成2mg/ml的溶液，即得。

（3）  阴性供试品溶液制备  根据处方比例，精密称取缺牡丹皮的其他药材粉末同法制成阴性样品溶液。

（4）  薄层色谱  精密吸取上述三中溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂：方法一：环己烷：乙酸乙酯（5：1）;方法二： 环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（4：1：0.1）[2-3]，展至15cm左右，取出，晾干，喷以盐酸（酸性5%）的三氯化鐵乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，结果表明：供试品溶液与对照品溶液显相同蓝褐色斑点且阴性样品没有斑点，专属性强。

3、 黄连定量研究

（1） 色谱条件考察  色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;柱温：25℃;流动相：乙腈- 0.1Mol/L磷酸二氢钾-0.025Mol/L十二烷基硫酸钠（50：25：25）[4];检测波长：265nm[5];流速：1ml/min;进样量：10μL。

（2） 供试品溶液的制备  取本品，剪碎，精密称取0.6g，置具塞锥形瓶中，并加入50mL甲醇：盐酸（100：1），密塞，摇匀，称定重量，超声处理45 分钟（功率800W，频率40Hz），放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

（3）  对照品溶液的制备  精密称取盐酸小檗碱对照品适量，用甲醇制成浓度为0.03562mg/mL的对照品溶液。

（4） 阴性样品溶液制备  根据处方比例，精密称取缺黄连的其他药材粉末，同法制成阴性样品溶液。

（5） 系统适用性试验  精密吸取浓度为0.03562mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液，连续进样6次，RSD为0.3%。

（6）  专属性试验  精密吸取上述三种溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积及相对保留时间，结果表明阴性样品溶液无干扰，此方法专属性强。

（7） 线性范围考察  取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成浓度为0.0708mg/ml的溶液，精密吸取2ml、3ml、5ml、10ml、20ml，置20mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得标准系列溶液。分别精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定其峰面积。以进样量作为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明在0.0708～0.7080μg（r =1）范围内线性关系良好（见图2.6）

（8） 精密度试验  精密吸取浓度为0.03562mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，RSD为0.3%。

（9）  溶液稳定性试验 精密吸取同一对照品及供试品溶液，分别在0、2、4、6、12、24小时进样，测定其峰面积，RSD均为0.3%，结果表明溶液在24小时内是趋于稳定的。

（10） 重复性试验 同法平行制备6份样品，计算其含量，平均含量1.65mg/g，RSD为0.1%，结果表明方法具有良好的重复性。

（11）  加样回收率试验  精密称取已知含量（1.65mg/g）的样品0.6g六份，加入浓度为0.03562mg/mL的盐酸小檗碱对照品1ml，同供试品溶液制备方法制备，计算回收率，平均回收率为99.6%，RSD为0.3%。

（12）  耐用性考察

（一）  柱温考察  在相同液相的条件下，精密吸取对照品溶液10μL和供试品溶液10μL，分别在柱温20℃、25℃和30℃进样，计算样品中盐酸小檗碱含量，试验结果表明，在设定柱温25℃上下浮动，色谱柱温度在20℃～30℃范围内，含量测定RSD为0.9%。

（二）  色谱柱考察  在相同液相的条件下，分别考察菲罗门、岛津和安捷伦三种不同品牌的C18色谱柱，精密吸取对照品溶液，注入液相色谱中，峰面积无显著变化。

（13） 检测限及定量限  以信噪比（S/N）3：1计，检测限为1.8ng;以信噪比（S/N）10：1计，其定量限为6.0ng。

（14）  样品含量测定  分别精密称取三个批次的样品，按供试品溶液的制备方法制备，测定每个批次样品中的盐酸小檗碱含量，结果分别为1.65mg/g、1.64mg/g和1.68mg/g。

二、 讨论

清热养阴丸原标准只有性状、显微鉴别和检查项，此次研究增加了对牡丹皮的薄层鉴别以及黄连的含量测定。牡丹皮薄层鉴别供试品的制备采用两种方法：一是加乙醚30ml，低温回流1小时;二是加乙醚10ml，密塞，振摇10分钟。两种方法均能提出牡丹皮中的丹皮酚，但振摇处理更简单快捷，故最后采用第二种方法。在牡丹皮的薄层鉴别中选择两种展开剂：一是环己烷：乙酸乙酯（5：1），Rf值为0.45;二是环己烷：乙酸乙酯：冰醋酸（4：1：0.1），Rf值为0.48;两种展开剂展开效果均不错。

采用高效液相色谱法测定样品中黄连含量时，流动相最初选用以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠（用磷酸调节pH值3.0）（30：70）[6]为流动相，由于阴性样品有干擾，且峰型不佳，故最后采用乙腈-0.1Mol/L的磷酸二氢钾-0.025Mol/L的十二烷基硫酸钠（50：25：25）为流动相。盐酸小檗碱在215nm、265nm、345nm处有最大吸收，最终选择265nm为检测波长，试验结果比较理想，且方法简便易行、专属性强、分离度好。

三、结论

通过对清热养阴丸中牡丹皮进行定性分析和运用高效液相色谱法对清热养阴丸中黄连的有效成分盐酸小檗碱进行定量分析，能对清热养阴丸质量进行有效控制。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：172.

[2] 王秀秦，吕渭升，林彤.双丹片质量标准研究[J]. 今日药学， 2017，27（01）：13-16.

[3] 王莹，康玉霞，雷丸，等.利清颗粒质量标准研究[J]. 解放军药学学报，2016，32（05）：408-410、479.

[4] 曹素萍，陈芳.黄连中小檗碱提取方法研究进展[J]. 海峡药学，2016，28（02）：39-41.

[5] 吕本强，范积平，张贞良，等.高效液相色谱法测定复方石栗喷雾剂中盐酸小檗碱含量[J].中国药业，2017，2（03）：15-17.

[6] 王炜辰，严国鸿，李煌，等.HPLC法测定蛇伤胶囊中盐酸小檗碱含量[J].山西中医学院学报， 2016，17（05）：26-28.

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