阿仑膦酸钠对大鼠成骨细胞的影响

赖蔚文，戴 闽，戴 玥

(1.南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330000；2.赣州市于都县人民医院，江西 赣州 342300)

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，在骨基质的合成、分泌和矿化中起到重要的作用[1]。成骨细胞的功能很大程度上取决于成骨细胞的成熟度和成骨细胞的状态[2]。所以成骨细胞功能多用于骨质疏松的临床评价中。阿伦磷酸钠作为治疗骨质疏松的一线药物，可以有效降低老年患者脊柱、髋部和非脊柱部位骨折的风险[3]。因此，本文主要探讨阿伦磷酸钠通过对成骨细胞的影响，从而为骨质疏松治疗方案提供新依据。

1 材料与方法

1.1实验材料：本研究实验材料及试剂见表1所示。

1.2方法：以6个月龄的20只SD大鼠作为实验研究对象，随机分为阿仑膦酸钠组B(n=10)和空白对照组(n=10)。空白对照组大鼠每日灌胃生理盐水，阿仑膦酸钠组B大鼠每日灌胃阿仑膦酸钠维D3的水溶液，剂量按照人鼠体表面积折算，剂量为 3.5 ml/(kg·d)。采用双能X线吸收法(DXA)分别于治疗前、治疗后26周和治疗后52周，测量大鼠腰椎L2～4、股骨颈、大转子与全髋关节4个部位的骨密度值，并比较治疗前后各部位骨密度的变化。选择Ⅱ型胶原酶处理SD级大鼠(24 h以内)，分离大鼠的颅骨，得到成骨细胞。在0.25%胰蛋白酶的消化传代进一步培养，得到二代细胞。随后取第二代成骨细胞，接种，细胞80%融合后弃去培养基；①换加入不同浓度阿仑膦酸钠(1.0×10-10～1.0×10-4)的无血清DMEM培养基，分别培养24 h、36 h、48 h，加入MTT溶液20 μl，于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养4 h，弃去上层溶液，加入DMSO试剂150 μl，轻轻振荡混匀，10 min后，用酶标仪测定490 nm波长下每孔的吸光度，确定不同浓度阿仑膦酸钠对成骨细胞增值促进、抑制作用；②换加含不同浓度阿仑膦酸钠溶液(0mol/L、1.0×10-7mol/L～1.0×10-4mol/L)的无血清DMEM培养基，分别培养48 h、72 h。弃培养基，以PBS清洗，加入0.1%Ttiton×100溶液250 μl。10 min后收集裂解液，取上清液，采用对硝基苯膦酸二钠法测定细胞碱性膦酸酶活性。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

表1 实验材料与实验试剂

2 结果

2.1用MTT法测定阿仑膦酸钠对大鼠成骨细胞增殖的影响:MTT检测结果显示：在24 h、36 h、48 h时，与空白组相比较，浓度为1.0×10-5mol/L和1.0×10-4mol/L的阿仑膦酸钠对成骨细胞的增殖有抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.05)。1.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L的阿仑膦酸钠对成骨细胞的增殖有促进作，差异具有统计学意义(P<0.05)。1.0×10-8mol/L增殖作用最强有非常显著性差异，有统计学意义(P<0.001)。见表2。

2.2成骨细胞分化实验结果:1.0×10-5mol/L和1.0×10-6mol/L浓度的阿仑膦酸钠药物可使大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶活性提高，差异有统计学意义(P<0.001)。见表3。

2.3骨密度值测定结果:与治疗前对比，阿仑膦酸钠组B治疗26周时，骨密度明显升高，差异有统计学意义(F=3.143，P<0.05);治疗52周时，骨密度升高显著，差异有统计学意义(F=9.719，P<0.00)。与空白对照组比较，在治疗26周时，两组骨密度具有明显差异，有统计学意义(F=4.171，P<0.05);在治疗52周时，两组骨密度亦差异显著，有统计学意义(F=4.946，P<0.05)。见表4。

表2 不同浓度的阿仑膦酸钠溶液在作用24 h、36 h、48 h后对大鼠成骨细胞增殖的影响

表3 阿仑膦酸钠作用48 h、72 h对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响(金氏单位/克蛋白，

表4 予以阿仑膦酸钠治疗前后腰椎L2-4、股骨颈、大转子与全髋关节4个部位的骨密度值比较

3 讨论

阿仑膦酸钠( Alendronate，ALN)是第三代双膦酸盐类药物，能够减少骨量丢失、增加骨密度从而达到预防骨质疏松性骨折的作用，是目前临床治疗骨质疏松症的一线用药[4]。过去临床上对骨质疏松症的研究中，多采用抑制破骨细胞功能的方式来增加骨密度，但抑制破骨细胞功能可能产生不良后果，所以临床研究中探究成骨细胞功能对预防和治疗骨质疏松为主要方向[5]。阿仑膦酸钠在一定浓度可促进成骨细胞增殖、增强ALP活性，是治疗骨质疏松的主要药物[6]。本次研究中以不同浓度的阿伦磷酸钠分析对成骨细胞的增殖分化及骨密度的影响，目的在于为临床治疗骨质疏松提供有效参考依据。

本研究通过将Ⅱ型胶原酶处理大鼠(24 h以内)，并分离大鼠的颅骨，得到成骨细胞。在0.25%胰蛋白酶的消化传代进一步培养，得到二代细胞。采用钙钴法对成骨细胞进行碱性磷酸酶染色，了解阿仑膦酸钠对于成骨细胞活性的影响，并探究不同浓度的阿仑膦酸钠对于大鼠成骨细胞的增殖分化情况，阿仑磷酸钠对SD大鼠骨密度值的影响。研究指出，阿仑膦酸钠能够诱导成骨细胞增殖分化。浓度为1.0×10-5mol/L和1.0×10-4mol/L的阿仑膦酸钠能够抑制成骨细胞的增殖作用；浓度为1.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L的阿仑膦酸钠对成骨细胞的增殖有促进作用；浓度为1.0×10-8mol/L的阿仑膦酸钠增殖作用最强有非常显著性差异；阿仑膦酸钠有利于提高大鼠的骨密度。

综上所述，阿仑膦酸钠能够诱导成骨细胞增殖分化，提高大鼠的骨密度。