NLRP3炎症小体与葡萄膜炎的关系

荆 锋，宋志红

陕西省渭南市大荔县医院：1.眼科;2.外三科,陕西渭南 715103

葡萄膜炎是临床中常见的致盲性眼科疾病，主要累及葡萄膜、视网膜、视网膜血管与玻璃体。该病好发于青壮年，病情较长，且存在反复发作等特点，治疗难度较大[1]。有研究指出，葡萄膜炎在我国致盲性眼病中排4～7位[2]。有研究指出，我国葡萄膜炎疾病中以Behcet病与Vogt-小柳原田综合征(VKH))为主[3]。目前，多数研究认为葡萄膜炎是一种炎症性疾病与免疫性疾病，但具体病因至今仍不明确，但大多数学者认为感染与免疫反应参与葡萄膜炎的发生[4-5]。随着医学技术的不断发展，作为固有免疫系统的重要组成部分，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体被认为参与了多种疾病的发生与预后，其在眼科疾病中的作用亦被多数学者认可，但其在葡萄膜炎中的的作用临床中研究较少。故笔者结合自身临床实践选取290例葡萄膜炎患者作为研究对象，旨在研究NLRP3在葡萄膜炎发生及预后中的作用，旨在为临床中该病患者诊断治疗提供帮助，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年4月至2020年2月本院收治的葡萄膜炎患者290例作为观察组，另选取同期在本院体检健康者280例作为对照组。观察组男155例，女135例，年龄26～42岁，平均(32.33±4.68)岁，均为中间型葡萄膜炎患者；对照组男143例，女137例，年龄25～43岁，平均(32.87±4.73)岁。2组性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得本院伦理委员会批准通过。

1.2纳入及排除标准 纳入标准：(1)本研究获得患者或其家属同意，并签署知情同意书；(2)玻璃体炎性细胞多于前房炎性细胞、玻璃体内典型雪球状混浊、特征性雪堤样病变、伴有后囊下白内障、黄斑囊样水肿、视盘炎、视网膜周边血管炎等患者。排除标准：(1)有其他眼科疾病如青光眼、结膜炎等患者；(2)患有严重的免疫疾病者；(3)患有精神抑郁类疾病或是长期服用相关药物者；(4)患者存在眼部疾病史或手术史者。

1.3方法

1.3.1试剂与仪器 4 ℃低温高速离心机购自长沙东旺实验仪器有限公司，荧光定量PCR仪购自西安天隆科技有限公司，酶标仪购自上海赛默科技生物发展有限公司，淋巴细胞分离液购自北京百奥莱博科技有限公司，酶联免疫吸附试剂盒购自南京信帆生物技术有限公司，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒均为天根生化科技(北京)有限公司生产。

1.3.2标本采集 抽取受试者清晨空腹静脉血6 mL共分为2份，1份至于室温下凝血后采用3 000 r/min离心10 min得到血清；另1份用肝素抗凝后，加入淋巴细胞分离液后离心，抽取悬浮于中层的单个核细胞备用。取血清标本按照酶联免疫吸附试剂盒说明书中步骤，配置蛋白浓度梯度标准品、适当稀释血清标本，随后进行点样抗体孵育、洗板等操作，最后在酶标仪上读取450 nm处的吸光值(A450)，对白细胞介素(IL)-1β表达水平进行记录观察。取外周血单个核细胞，采用RNA抽提试剂盒提取细胞中的RNA，随后紫外分光光度计测定浓度后取2 μg RNA进行反转录，得到cDNA样本后即逆行PCR扩增，NLRP3引物序列参考文献[6]，经溶解曲线验证后用于实验。

1.4观察指标 检测2组受试者NLRP3表达与IL-1β水平，随后根据文献[6]标准对患者疾病严重程度进行评分，结膜睫状充血记1分，房水细胞或房水闪辉阳性记1分，角膜后沉着物记1分，虹膜粘连记1分，伴玻璃体细胞、黄斑囊样水肿、并发白内障或继发性青光眼等并发症的其中任何一项记1分，计算患者总得分，并分析评分与NLRP3、IL-1β的相关性。对观察组患者随访3个月，根据其治疗效果分为预后良好组、预后较差组。疗效判定根据本院自制的标准进行，预后良好组：患者临床症状表现消失，视力提高1～3行，3个月内无复发；预后较差组：患者临床症状无明显改善，视力无明显提高或下降，眼底荧光血管造影视网膜血管渗漏有所减轻，但改善程度较小。分析2组患者NLRP3、IL-1β表达情况，采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析NLRP3与IL-1β对预后良好患者的预测价值。

2 结 果

2.12组NLRP3相对表达水平与IL-1β水平比较 观察组NLRP3相对表达水平[(245.43±30.58)]、IL-1β水平[(78.73±9.08)ng/L]均高于对照组[(105.33±14.85)、(13.84±2.03)ng/L]，差异均有统计学意义(t=69.187，P<0.001；t=116.794，P<0.001)。见图1。

2.2观察组患者疾病严重程度与NLRP3、IL-1β的相关性 290例患者疾病严重程度评分为(4.61±1.27)分，采用Pearson相关分析显示，疾病严重程度评分与NLRP3、IL-1β均呈正相关。见图2、3。

图1 观察组与对照组NLRP3相对表达水平及IL-1β水平柱状图

图2 疾病严重程度评分与NLRP3的相关性

图3 疾病严重程度评分与IL-1β的相关性

2.3随访3个月预后良好组与预后较差组患者NLRP3相对表达水平及IL-1β水平比较 随访3个月预后良好组患者188例，预后较差组患者102例，预后良好组患者NLRP3相对表达水平[(155.32±25.38)]、IL-1β水平[(43.28±7.65)ng/L]均低于预后较差组[(193.27±28.82)、(58.39±8.66)ng/L]，差异均有统计学意义(t=9.561，P<0.001；t=12.653，P<0.001)。见图4。

图4 预后良好组与预后较差组NLRP3相对表达水平及IL-1β水平柱状图

2.4NLRP3、IL-1β对预后良好患者疗效的预测价值 采用ROC曲线分析NLRP3、IL-1β对预后良好患者疗效的预测价值，结果显示，NLRP3、IL-1β预测预后良好组患者的AUC为0.884(95%CI：0.835～0.934)、0.880(95%CI：0.832～0.928)，最佳临界值为178.52、51.17 ng/L，灵敏度为88.6%、84.1%，特异度为78.4%、82.4%。见表1、图5。

表1 NLRP3、IL-1β对预后良好患者疗效的预测价值

图5 NLRP3、IL-1β对预测预后良好组患者疗效的ROC曲线图

3 讨 论

葡萄膜炎的发病机制至今未得到证实，但多数学者认为与自身免疫功能紊乱有较强的关系，且动物实验也证明，免疫应答、花生四烯酸、前列腺素、白三烯等炎症因子的释放会导致葡萄膜炎的发生[7-8]。随着临床研究的不断深入，NLRP3炎症小体进入学者视线，有较多研究指出，NLRP3参与多类眼部疾病的发生及疾病进展[9-11]。另有研究指出，NLRP3炎症小体可活化IL-1β等细胞因子前体，使其成熟并释放[12-13]，而IL-1β在葡萄膜炎中的作用亦十分重要，葡萄膜炎患者IL-1β水平会随着疾病的进展应激性增高[14]。

本研究显示，观察组患者NLRP3相对表达水平与IL-1β水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明葡萄膜炎患者发病后NLRP3与IL-1β水平均会出现应激性升高。有研究指出，葡萄膜炎患者NLRP3与IL-1β水平可出现显著升高，这主要是因NLRP3激活Toll样受体3/4通道，引起人体炎性反应，随着疾病的进一步发展，活性氧簇被激活，导致IL-1β细胞因子前体被活化并大量释放，最终引起NLRP3与IL-1β表达水平提升[15-16]。此外，活性氧簇可通过硫氧蛋白相互作用蛋白激活NLRP3炎症小体，即当活性氧簇水平升高时，掌握人体氧化能力的氧化还原酶硫氧还蛋白自生发生解离，而作为上配体的NLRP3因此得到激活，刺激其下游炎症小体IL-1β水平提升，从而导致葡萄膜炎的发生与疾病进展[17]。

本研究对患者疾病严重程度评分与NLRP3、IL-1β相关性分析显示，疾病严重程度评分与NLRP3、IL-1β均呈正相关，表明NLRP3与IL-1β参与患者疾病进程。本研究对患者随访3个月发现，预后良好组患者NLRP3与IL-1β水平均低于预后较差组。ROC曲线分析显示，NLRP3、IL-1β预测预后良好组患者的AUC分别为0.884(95%CI：0.835～0.934)、0.880(95%CI：0.832～0.928)，NLRP3与IL-1β对患者的预后具有较高的预测价值，说明NLRP3与IL-1β参与了患者疾病预后进程。NLRP3胞内某些模式识别受体能够感受到细胞外的危险信号，这有助于炎症因子的成熟，从而参与人体免疫反应。NLRP3是目前研究较多的炎症小体，其功能异常与许多先天、后天免疫性疾病有关。本研究结果显示，NLRP3与IL-1β参与葡萄膜炎患者的疾病进程及预后，且二者与疾病严重程度也具有关系，可能是NLRP3与IL-1β之间相互影响所致。NLRP3可识别各种外源性、内源性炎症信号，通过不同的识别受体，促进炎症因子的生成，并产生炎症免疫反应；IL-1β是白细胞介素家族中的重要组成因子，主要由单核巨噬细胞合成与分泌，当NLRP3被活化后，将前体形式的IL-1β剪切成为成熟具有活性的炎症因子，从而参与到人体疾病的进展与发展中[18]。

综上所述，NLRP3作为固有免疫系统的重要组成部分，其参与了葡萄膜炎疾病的发生、发展及预后进程。NLRP3被活化后可激活下游IL-1β炎症因子的分泌，共同参与葡萄膜炎疾病发展。但NLRP3在葡萄膜炎患者中的具体作用机制仍需进一步明确，以期为临床中葡萄膜炎患者的治疗提供全新靶点。