急性带状疱疹患者Treg和IL-35水平与带状疱疹后遗神经痛的相关性分析*

刘 洁，伍严安，林妙春，李雪丽，朱婵虹

福建医科大学附属闽东医院：1.检验科；2.中心实验室；3.皮肤科，福建宁德 355000；4.福建医科大学省立临床医学院/福建省立医院检验科，福建福州 350000

水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染人体后，机体特异性细胞免疫紊乱所造成的细胞因子分泌异常可能与带状疱疹后遗神经痛(PHN)的发生发展密切相关[1-2]。调节性T细胞(Treg)是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群，抑制效应性T细胞的增殖及分化[3]。急性带状疱疹(AHZ)患者外周血中Treg的比例明显升高，且比例越高的患者越容易形成PHN，可见Treg的活跃度与PHN关系密切。虽然Treg分泌多种细胞因子[如：转化生长因子-β、白细胞介素(IL)-10]，但没有证据表明上述因子与PHN直接相关。若能寻找到关键因子，则对PHN的预防和临床治疗具有重要意义。

近年来发现IL-35是IL-12家族的新成员，一种主要由Treg分泌的新型抑制性细胞因子，由P35亚基和EB病毒诱导基因3(EBI3)组成的异源二聚体[4]。IL-35是Treg发挥其最大抑制效应所需的一种细胞因子，参与多种自身免疫性疾病和感染性疾病的病理过程，但目前IL-35与带状疱疹的相关研究报道少见。本研究拟通过检测AHZ患者外周血中Treg及IL-35的表达情况，探讨Treg及IL-35水平与PHN之间的关系，为将来的临床干预提供一定思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年11月至2018年10月在福建医科大学附属闽东医院就诊的76例AHZ患者及20例体检健康者分别纳为观察组、对照组。观察组中8例患者失访，最终68例患者进行统计学分析，其中男35例、女33例，平均年龄(59.50±16.81)岁；对照组男9例，女11例，平均年龄(59.80±11.07)岁。2组在性别比例、年龄分布上比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：患者均符合《中国临床皮肤病学》[5]中AHZ的诊断标准；发疹至就诊时间≤7 d；VZV IgG抗体阳性。排除标准：皮疹不伴疼痛者；合并自身免疫性疾病者；近3个月内使用过免疫抑制药物、激素或生物制剂者；严重感染的患者；妊娠及哺乳期妇女；肿瘤患者。

1.2方法

1.2.1标本收集及处理 采集外周静脉血7 mL。其中血清管3 mL以3 000 r/min离心10 min，分离出血清于-80 ℃条件下保存；另外两管各2 mL使用EDTA抗凝，12 h内分别进行流式细胞学及分子生物学检测。

1.2.2外周血CD4+T细胞、Treg检测 抗凝全血200 μL，分别加入5 μL CD3-PE-Cy7抗体、10 μL CD4-FITC抗体和10 μL CD25-APC抗体(美国BD公司)，避光孵育30 min；加入2 mL的溶血素，避光孵育10 min；磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次；加入1 mL破膜固定液，4 ℃避光孵育40 min；破膜洗涤后，加入100 μL破膜洗液和10 μL FoxP3-PE重悬细胞(美国BD公司)，4 ℃避光孵育40 min，洗涤2次后，PBS重悬细胞，采用FACS Caliber流式细胞仪(美国BD公司)分析CD4+T细胞、Treg。

1.2.3外周血单个核细胞(PBMC)中IL-35(EBI3和p35)mRNA表达水平的检测 分离PBMC，采用Trizol法提取RNA，按照反转录试剂盒说明书(北京康为世纪生物科技有限公司)进行反转录反应，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参进行实时荧光定量PCR扩增，分析EBI3 mRNA及P35 mRNA的相对表达水平。引物(上海生工生物股份有限公司)序列见表1，总反应体系25 μL，反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40个循环。通过ΔCt比较各组目的基因的相对表达水平(ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct)。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.4血清IL-35水平测定 采用ELISA试剂盒(武汉USCN生物科技有限公司)测定血清中IL-35的含量，所有步骤按说明书进行。

1.2.5随访 3个月后对患者进行电话随访，采用数字评分法(NRS)对疼痛进行评估。以带状疱疹侵犯区域是否存在疼痛(NRS≥1分)为标准来判断是否出现PHN，根据随访结果将所有患者分为PHN组和无PHN组。

2 结 果

2.1PHN的发生率 经随访，68例AHZ患者中有21例出现PHN，PHN的发生率为30.88%。

2.2外周血CD4+T细胞和Treg水平比较 与对照组比较，观察组CD4+T细胞水平降低(t=5.440，P<0.001)，Treg水平升高(t=6.656，P<0.001)。根据3个月后的随访结果，将观察组分为PHN组和无PHN组，2组比较，PHN组CD4+T细胞水平低于无PHN组(t=2.300，P<0.05)，Treg水平高于无PHN组(t=3.856，P<0.001)。见图1、2。

注：A为各组CD4+T细胞水平比较；B为各组Treg水平比较。

注：A、B、C分别为对照组、PHN组、无PHN组CD4+T细胞流式细胞术检测图；D、E、F分别为对照组、PHN组、无PHN组Treg流式细胞术检测图。

2.3CD4+T细胞水平和Treg的相关性 采用Pearson相关系数分析显示，CD4+T细胞水平和Treg呈负相关(r=-0.640，P<0.001)。见图3。

2.4PBMC中IL-35(EBI3和P35)mRNA的相对表达水平比较 与对照组相比，观察组EBI3 mRNA的相对表达水平降低(t=2.521，P<0.05)，P35 mRNA相对表达水平差异无统计学意义(t=1.725，P=0.096)。PHN组与无PHN组之间IL-35(EBI3和P35)mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

2.5血清IL-35水平比较 观察组IL-35水平[(55.17±17.84)pg/mL]低于对照组[(68.69±19.78)pg/mL]，差异有统计学意义(t=2.820，P<0.01)，而PHN组IL-35水平[(52.28±15.31)pg/mL]与无PHN组[(57.04±18.48)pg/mL]比较，差异无统计学意义(t=1.016，P>0.05)。

图3 AHZ患者外周血CD4+T细胞与Treg水平的相关性

注：A为4组的EBI3 mRNA的ΔCt；B为4组的P35 mRNA的ΔCt。ΔCt越高说明目的基因的Ct值越大，而Ct值越大mRNA的相对表达水平就越低。

3 讨 论

带状疱疹多见于老年人和免疫功能低下的人群，既往的研究发现，带状疱疹患者外周血CD4+T细胞水平下降，CD8+T细胞水平升高，CD4+/CD8+T的比例降低，且T细胞功能亦发生改变[6-8]，可见机体免疫功能异常导致的T细胞亚群失衡与带状疱疹的发生密切相关。本研究中，68例观察组患者中有21例出现了PHN，发生率为30.88%。与对照组相比，观察组CD4+T细胞水平降低，PHN组CD4+T细胞水平也低于无PHN组，这与之前学者的研究结论相符。VZV活化后机体免疫系统的负向调控机制可能通过某种途径被激活，针对VZV的特异性细胞免疫应答被抑制，其抑制程度越重越容易形成PHN。

本研究显示，观察组CD4+T细胞水平下降而Treg水平升高，二者呈负相关，这与XING等[9]的报道一致。笔者推测AHZ患者CD4+T细胞介导的宿主抗病毒免疫应答受抑制可能与外周血中激活的Treg有关，机体病毒清除能力下降，持续性的病毒血症，神经系统被VZV不断攻击，从而引发神经炎症反应，在各种炎症因子的刺激下，最终导致PHN的发生。目前仍不清楚在AHZ患者中Treg是如何负向调节免疫系统功能。

IL-35是最新发现的调控Thl7/Treg分化的重要细胞因子，它是Treg的功能执行者，可诱导表达IL-35的Treg(iTr35)生成，促进Treg的增殖，同时抑制效应性T细胞和Thl7细胞的分化。据报道IL-35不同程度地参与了胰腺癌[10]、炎症性肠病[11]、Ⅰ型糖尿病[12]、系统性硬化症[13]、类风湿性关节炎[14]及乙型肝炎[15]的发病。在国内外IL-35已逐渐被运用于临床疾病的研究，而对于IL-35与神经病理性疼痛的关系、及其在AHZ和PHN之间关系的相关研究较少。本研究发现，AHZ患者外周血PBMC中EBI3 mRNA相对表达水平和血清IL-35的水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；尽管观察组P35 mRNA的相对表达水平与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，但它与血清IL-35的变化是一致的，都出现下降趋势。这些结果与VZV感染后Treg的变化情况不一致。理论上IL-35主要由Treg分泌，IL-35的表达水平应该与Treg的功能变化同步，但本研究却发现并非如此，推测可能的原因有：Treg确实参与AHZ和PHN的发病过程，但在带状疱疹的病程中，IL-35可能并不是Treg发挥抑制细胞免疫功能的主要执行者，或者它并不参与抑制细胞免疫的过程；抑或是本研究样本量较少，无法准确获得IL-35在疾病过程中的实际变化情况。

综上所述，在急性带状疱疹中Treg参与负向调节T细胞亚群，与PHN的发生有关；而IL-35可能不参与Treg的细胞免疫抑制过程，需要将来进一步研究阐明。