双酚A荧光检测方法的建立及应用

汪海洋，江姗姗，徐龙华

（山东农业大学食品科学与工程学院山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东泰安271018）

双酚A（Bisphenol A），结构式如图1 所示，化学式为C15H16O2，学名为2，2-二（4-羟基苯基）丙烷，简称二酚基丙烷。

图1 双酚A 的结构式Fig.1 Chemical structure of bisphenol A

双酚A 是一种重要的有机化工原料，主要用于生产环氧树脂、聚碳酸酯等多种高分子材料，是目前中国需求量增长最快的化工产品之一[1]，其作为功能单体可以使材料无色透明、轻巧耐用和防冲击[2]，在合成过程中不完全的聚合反应，及后续使用过程中的分解，都可能导致双酚A 单体残留，进而迁移到环境和食品中[3]。由于环境的污染，使得双酚A 无处不在，从矿泉水瓶、医疗器械到食品包装的内里，都有它的身影[4-5]。双酚A 作为典型的环境激素类物质，长时间低剂量暴露，会对人体的内分泌系统、神经系统、免疫系统和生殖系统等构成危害，甚至存在诱发癌症的风险[6-9]，因此，双酚A 的检测倍受关注，推动着其检测技术的进步与发展。

目前，双酚A 的各种检测方法，如酶联免疫吸附法[10-12]、荧光分光光度法、电化学分析法[13]、气相色谱法、高效液相色谱法[14]、气相色谱串联质谱联法[15]、液相色谱串联质谱法[16-17]均已建立。其中荧光检测以其操作简单、灵敏度高、选择性好、响应时间短等优势，成为开发双酚A 快速精准检测方法的首选。针对双酚A的荧光检测方法可以分为两大类，一类是利用双酚A自身荧光特性所建立的检测方法，另一类是通过引入荧光染料、量子点、金纳米颗粒等外源性荧光信号物质，基于双酚A 与外源性物质荧光信号之间的相互作用而建立的检测方法。

1 基于双酚A 自身荧光特性建立的检测方法

1.1 荧光分光光度法

荧光分光光度法是根据物质分子吸收光谱和荧光光谱能级跃迁机理进行物质鉴定和含量测定的方法[18]。双酚A 分子存在共轭体系，在特定波长光激发后能产生荧光，从而对其进行定量检测。唐舒雅等[19]基于在pH 1 的酸性介质中，利用β-环糊精对双酚A 荧光强度的增强作用，建立了水样中双酚A 残留检测的荧光分光光度法，该法的线性范围为0.4 μg/L ～300.0 μg/L，相对标准偏差为1.3%，检出限为0.020 μg/L，并应用该方法于聚碳酸酯膜（polycarbonate，PC）浸泡水样中双酚A 残留量测定。余宇燕等[20]采用β-环糊精包被双酚A，由于β-环糊精具有的疏水性内腔可以减少双酚A分子旋转自由度及水的松弛效应，避免外界空气、水、离子对产生的荧光单重态的干扰，从而使双酚A 荧光量子产率增大，实现了食品包装材料中双酚A 荧光定量检测，在pH 4，激发波长和发射波长分别为282 和318 nm 时，该方法的检出限为0.2 μg/L，线性范围为1 μg/L ～10 μg/L，回收率为98%～102%。

1.2 高效液相色谱-荧光检测法

高效液相色谱是目前有机物分析的常用方法，由于荧光检测的灵敏度要高于紫外，而双酚A 本身具有荧光特性，因此高效液相色谱-荧光检测在双酚A 定性定量分析中得以广泛应用。葛宇等[21]以乙腈作为提取液，用超声辅助提取的方式，采用ZORBAX SB-C18柱分离，荧光检测器检测，建立了罐头食品中双酚A和6 种双酚A 二缩水甘油醚衍生物含量的高效液相色谱-荧光检测法，该方法的检出限在0.04 mg/L ～0.1 mg/L范围内。赖红娟等[22]同样采用超声辅助提取，以甲醇-四氢呋喃（70∶30，体积比）作为提取液，建立了一次性纸杯中双酚A 高效液相色谱-荧光检测方法，双酚A在0.5 mg/L～50.0 mg/L 线性范围内呈现良好的线性关系，相关系数为0.999 8，相对标准偏差为3.10%～5.20%，检出限为0.05 mg/L。于杰等[23]采用高效液相色谱-荧光法对食品包装材料中双酚A 及双酚S 的迁移量进行测定，该方法在0.001 μg/L～0.100 μg/L 范围内线性关系良好，并采用此方法研究了不同模拟液对食品包装材料中双酚A 和双酚S 迁移量及迁移特性。Tu等[24]等采用糖化辅助液-液萃取前处理与高效液相色谱-荧光法测定相结合，开发了复杂基质—蜂王浆中双酚A 和双酚B 的同时分析方法，该方法对两种物质的最低检出限为16、18 μg/kg，平均添加回收率为88.32%～93.59%、95.14%～97.48%。Li 等[25]设计合成了新型复合材料金属有机骨架/壳聚糖/聚氧乙烯复合材料并以此作为吸附剂，开发了涡流辅助固相萃取流程，结合高效液相色谱-荧光检测方法，实现了塑料包装的饮料和水中双酚A 及其结构类似物的检测，该方法的线性范围为0.1 mg/L ～20 mg/L，对双酚A 的检出限为0.019 μg/L。

此外，通过改进样品前处理设备，高通量、快速检测方法也相继被建立。Guo 等[26]利用DryLab 软件建立了一种基于高效液相色谱-荧光检测（high performance liquid chromatography fluorescence detector，HPLC -FLD）方法，对分离孔进行了优化设计，快速测定罐头食品中双酚A 及其衍生物，在包括平衡时间在内的5 min内实现了充分的分离，双酚A 检出限为0.01 μg/kg，分析回收率为70.46%～103.44%。Lopes 等[27]将一种中空纤维再生液膜萃取与96 孔板体系相结合，采用高效液相色谱-荧光和二极管阵列检测，实现了水样中双酚A、4-壬基酚、对辛基苯酚、叔辛基苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、羟苯乙酯的高通量分析检测，其对双酚A 的检出限可达8 μg/L。

1.3 荧光光谱与统计学结合分析方法

随着分析数据日益复杂，传统的分析手段已经不能满足复杂分析的需求，荧光光谱技术与化学计量学、统计学相结合成为实现复杂体系中双酚A 准确分析的重要手段，得到各国学者的广泛认可。Spagnuolo等[28]将化学计量学二阶校正法与激发-发射矩阵荧光光谱相结合，采用平行因子法对所得数据进行分析，建立了非分离、简便、快速的双酚A 光谱荧光测定方法，实现了聚碳酸酯杯中双酚A 迁移量的测定，该方法的具有较宽的线性范围0～720 μg/L。Chen 等[29]也采用激发-发射矩阵荧光光谱与化学计量学二阶校正方法相结合，实现了聚碳酸酯塑料中双酚A 和碳酸二苯酯2 种组分的同时测定，该方法对两种物质的最低检出限分别为0.04、1.18×103μg/L，平均添加回收率分别为99.35%和83.50%。

1.4 便携式远程实时荧光检测方法

便携式远程检测平台的搭建，对于环境及其他介质中双酚A 污染暴露水平的快速检测和实时监测均具有重要意义。Long 等[30]构建了便携式、自动化荧光微阵列生物传感平台（fluorescence microarray biosensing platform，FMB），通过光纤开关的控制，在时间分辨效应的基础上，借助激发光源和光电二极管探测器可实现对于双酚A 的四通道并行荧光检测，其检出限为0.03 μg/L。此外，随着智能设备的发展和普及，有研究者将将荧光光谱与智能手机端相结合应用于水样中双酚A 的检测[31]，效果理想。

2 基于外源性荧光物质检测双酚A 的方法

利用双酚A 与外源性荧光物质之间的荧光响应行为，是目前实现双酚A 荧光检测的常用手段。随着材料学的发展，外源性荧光物质也从最初的荧光染料发展到现在的量子点、碳点、金纳米颗粒、上转换纳米颗粒等，带动了双酚A 的荧光检测技术的不断发展和完善。

2.1 基于传统有机荧光染料的荧光检测

常用的有机荧光染料标记物是荧光素类以及罗丹明类染料。和荧光素相比，罗丹明类标记物的荧光产率较小，但其发射波长较长，样品背景干扰较小[32]。王广军等[33]基于酸性介质中双酚A 对溴酸钾氧化丁基罗丹明B 荧光猝灭具有抑制作用，建立了抑制动力学荧光法测定痕量双酚A。方法的线性范围0.08 mg/L～0.88 mg/L，检出限为0.005 mg/L，回收率在95%～103%之间。该方法可应用于婴幼儿奶瓶、假牙和地表水中双酚A 含量的测定。

为了提高荧光探针对双酚A 的选择性，Li 等[7]等使用荧光染料AHN 标记适配体，利用核酸适配体与目标物的高亲和力和强特异性，结合磁性纳米颗粒的快速分离优势，建立了磁响应核酸适配体荧光探针，应用于实际环境水样中双酚A 的高选择性灵敏检测，其检出限为强特异性0.047 μg/L。Hu 等[34]基于荧光素标记的双酚A 适配体与磁性氧化石墨烯之间的荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET），开发了双酚A 高选择性“turn-on”型荧光检测方法。磁性氧化石墨烯（magnetismgrapheneoxide，MGO）可吸附荧光素标记的双酚A 适配体形成复合物，从而有效地抑制荧光素的荧光。而在双酚A 存在的情况下，抗双酚A 适配体会倾向于改变其构型与双酚A 靶标结合，从而在MGO 表面脱附，然后通过磁分离使体系荧光恢复。该生物传感器具有较强的抗干扰能力和灵敏度，检测限为0.071 μg/L，线性范围为0.2 μg/L ～10 μg/L。

2.2 基于半导体量子点（quantum dots，QDs）的荧光检测

与传统有机荧光染料相比，量子点具有明显优势，如可调的宽吸收光谱、窄而对称的发射光谱等，广泛应用于荧光成像和化学传感领域。通常采用表面功能化修饰，来提高量子点探针的选择性和灵敏度，使其可以广泛的应用于不同需求的领域。基于双酚A 对探针的荧光猝灭效应，Kuang R 等[35]采用半胱胺修饰CdTe QDs 作为探针，建立了奶瓶中痕量双酚A 荧光猝灭测定方法；Kadam 等[36]用环糊精功能化ZnO QDs，用于双酚A 的选择性检测，其检出限为0.19 μg/L（低于水生生物群的毒性限值），可满足实际检测需求；Cao 等[37]制备了壳聚糖修饰的硫化锌量子点ZnS QDs，建立了水和塑料中双酚A 的定量检测方法，该法线性范围为0.50 μg/L ～300 μg/L，检出限为0.08 μg/L。此外，采用分子印迹技术替代表面修饰，也成为制备高选择性和特异性荧光探针的通用方法。Kim 等[38]以分子印迹聚合物包被硒化镉量子点CdSe QDs 作为荧光探针，借助分子印迹聚合物对目标物分子的特异识别性能，实现了双酚A 高选择性传感检测，与其结构类似物相比对双酚A 具有更大的猝灭常数。Zhang 等[39]将羧基功能化的磁性纳米颗粒与巯基乙胺包封的Mn2+掺杂的ZnS量子点偶联，结合分子印迹技术合成了磁性核-壳型荧光探针（FeOx/ZnS@MIPs），对双酚A 的检出限为0.362 6 μg/L。

2.3 基于碳点（carbon dots，CDs）的荧光检测

碳点是人们在碳纳米材料中发现的一种具有量子点特性的球状颗粒，具有独特的光学特性、良好的生物相容性、低毒性，易于制备且耐光漂白[40]，因其优异的性质近年来得到迅速发展。在食品检测领域，通常被用来制作各种荧光探针以及传感器，任悦等[41]制备了碳点修饰的硅胶颗粒SiO2@CDs，基于双酚A 对KBrO3氧化碳点而导致荧光猝灭的抑制作用，建立了检测双酚A 的方法，检出限为5.2 μg/L，并成功用于塑料制品中双酚A 的测定。为了降低基质干扰，实现样品中双酚A 的特异性检测，通常引入分子印迹聚合物来提高方法的选择性，Liu 等[42]采用原位水热合成法制备了分子印迹聚合物基体包覆碳点的荧光生物传感器，并基于此传感器成功建立了一种双酚A 的荧光检测方法，方法检测限为30 nmol/L，成功应用于河流水样的检测。Wang 等[43]基于适配体的特异性识别和AuNPs 对氮掺杂碳点的荧光的抑制作用，建立了一种快速简便、低成本的双酚A 检测方法，方法检出限为3.3 nmol/L，并成功应用于自来水样品中的双酚A检测。氮掺杂碳点对环境友好、经济有效，具有优异的光致发光性能，通过掺杂和功能化能够改变其光学性质，提高量子产率，同样可应用于双酚A 检测领域[44]。

2.4 基于上转换纳米颗粒的荧光检测

传统的下转换荧光材料的发光过程是将高频激发光转为低频发射光，发出的能量小于吸收的能量，可能会导致发光效率低、灵敏度低等问题，为了解决这些问题，可以制备具有强荧光效率的上转换纳米粒子来替代传统的荧光粒子，而且上转换纳米粒子可以进行定量修饰，更加拓宽了它的应用范围。Li 等[45]采用了一种修饰了的上转换纳米颗粒（up conversion nanoparti cles，UCNPs）与四甲基罗丹明之间的荧光共振能量转移效应，建立了一种用于痕量双酚A 检测的超灵敏传感器，在最佳检测条件下，547 nm 处UCNPs 的峰值强度与双酚A 浓度的对数呈线性关系，检测限为0.05 ng/mL，自来水、河水和一次性纸杯水的回收率一般在91.0%～115.0%之间。为了进一步缩短检测时间，简化操作步骤，Sheng 等[46]使用抗双酚A 抗体偶联羧基功能化的上转换发光纳米颗粒作为信号探针，包被抗原共轭羧基功能化的磁性聚苯乙烯微球作为捕获探针，建立了一种灵敏的荧光免疫分析法来检测桶装饮用水以及瓶装矿泉水中的双酚A，水样中双酚A 的检出限为0.02 μg/L。

2.5 基于双发射荧光检测

目前，大多数荧光探针都是通过单发射信号的荧光响应变化来达到检测的目的，但这种单一的信号变化很容易受到外部因素的干扰，所以近年来一些荧光校正的方法得到了快速的发展，比如利用探针的双发射荧光可对比的特性进行校正，Xiang 等[47]提出了一种简单有效的荧光纳米传感器的设计方法，在染料掺杂的二氧化硅纳米颗粒表面涂覆碳点，制备了双酚A 双发射纳米传感器。双发射二氧化硅纳米粒子的荧光在盐酸中被溴酸钾氧化猝灭（双酚A 抑制KBrO3氧化，导致双发射二氧化硅纳米颗粒的比色荧光反应），基于此效应，建立了一种双酚A 荧光检测方法，其检出限为0.80 ng/mL，该方法已成功应用于不同塑料制品浸出液中双酚A 的测定。比色荧光传感器的构建往往涉及繁琐的制备过程或者复杂的修饰过程，双发射荧光纳米粒子的出现则大大简化了传感器的制备过程及修饰过程，Lu 等[48]研究了一种基于双发射纳米颗粒（dual emission nanoparticles，D-NPs）的比率荧光分子印迹传感器用于双酚A 的检测，该纳米颗粒由碳点和金纳米团簇组成，提高了传感器的灵敏度，其检测限为29 nmol/L，并成功用于水样、罐头食品以及塑料制品中双酚A 的检测。

3 展望

现有双酚A 常用的检测分析方法虽然精准化、多样化，但是在简便性和快捷性方面还有待进一步提高，比如实验室多用色谱法来检测双酚A，但色谱法需要繁琐的前处理过程，检测周期较长，检测成本较高，且不适用于现场快速检测。荧光检测方法使用仪器简单，检测灵敏度高、选择性好、响应时间短，是一种经济有效的检测方法，现有的荧光检测技术慢慢突破了传统荧光技术的限制，如上转换纳米材料可以将低能光转化为高能光，与下转换荧光纳米材料相比，解决了发光效率低、灵敏度低等问题；双发射荧光的此消彼长特性可以进行荧光的自我校正，大大降低了外部因素对荧光信号的干扰，其他荧光检测方法的有效改进也在稳步进行，相信荧光检测法在双酚A 的检测领域中会有巨大的发展前景。