麦胚球蛋白对亚硝酸盐急性中毒大鼠肝损伤的保护作用研究

赵肃，吴兴泉*，黄继红，2*，潘龙，廖爱美，李肖肖，苑永建，郑帅楠，董瑜琪，张杰

（1.河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001；2.河南科谱特医药科技研究院有限公司，河南洛阳471000）

亚硝酸盐是人体内正常成分，在体内直接或间接还原为一氧化氮后，在细胞呼吸转导、调节天然免疫力、改善肠胃和心血管健康等方面发挥重要的生物学作用[1]。在食品领域，亚硝酸盐作为着色剂、风味剂和抗氧化剂经常用于肉类制品加工中[2]。在工业上，它被用于合成染料、化学品以及橡胶的制造[3]。在医学上，它被用作血管扩张剂和氰化物解毒剂[4]。根据研究报道，低剂量的亚硝酸盐对人们的健康有一定益处，但是高水平的亚硝酸盐会造成高铁血红蛋白症、呼吸道疾病、神经功能障碍以及癌症等健康问题[5]。

近些年来，食源性天然产物用于辅助药物治疗或预防亚硝酸盐中毒成为一种趋势。有研究发现5 mg/kg鱼肝油能够提高大鼠组织抗氧化能力，保护大鼠肝细胞免受氧化应激损伤[6]。Elsherbiny 等[7]研究发现，25 mg/kg 和50 mg/kg 百里香坤（thymoquinone，TQ）都能够抑制亚硝酸盐引起的氧化应激，恢复促炎和抗炎因子平衡，对大鼠肾损伤具有明显的保护作用。此外，还有藏红花[8]、大蒜油[9]以及姜黄素[10]等一系列食源性天然产物对亚硝酸盐危害具有预防作用。

麦胚球蛋白（wheat-embryo globulin，WEG）是以脱脂小麦胚为原料制备分离的一种植物蛋白，氨基酸比例均衡，具有抗炎、抗衰老以及提高机体免疫力等作用[11-12]。但是预防亚硝酸盐急性中毒尚未见报道。因此本研究探讨麦胚球蛋白对单次口服亚硝酸盐引起肝损伤的保护作用，旨在为麦胚球蛋白高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD 雄性大鼠，体重160g～180g，由郑州大学动物实验中心提供（动物质量合格证号NO.4100 3100006 969，许可证号SCXK 豫2017-0001）。

1.2 材料与试剂

麦胚球蛋白口服液（其中麦胚球蛋白≥1%）：河南省科谱特医药科技研究院有限公司。

亚硝酸钠（≥99.999%）：天津市致远化学试剂有限公司；维生素C（食品级）：石药集团维生药业（石家庄）有限公司。总蛋白定量测定试剂盒（bicinchonininc acid，BCA）：南京建成生物工程研究所；5-磺基水杨酸（≥99.0%）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）：北京索莱宝科技有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）：湘中地质实验研究所；氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、多聚甲醛、四乙氧基丙烷（≥97.0%）：上海麦克林生化科技有限公司。以上化学试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器与设备

5810R 台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf 公司；XHF-D 高速分散器：宁波新生物股份有限公司；LT1002E 电子天平、723N 可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；AU5800 全自动生化分析仪：美国贝壳曼公司；Tecan Infinite pro 酶标仪：瑞士帝肯有限公司；FMB-20 制冰机：杭州聚同电子有限公司。

1.4 实验动物分组及处理

将42 只雄性大鼠饲养于河南工业大学生物工程学院，室温控制在24 ℃～26 ℃，相对湿度为40%～70%，定期更换垫料和进行鼠笼消毒，饲料标准符合GB 14924-2010《实验动物配合饲料营养成分》，饮用水标准符合GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》，宿舍标准符合GB 14925—2010《实验动物环境及设施标准》。参照文献[13]，略作修改，将大鼠适应性喂养7 d后，用随机数字表法把大鼠分为空白组、模型组、麦胚球蛋白组（80 mg/kg）、麦胚球蛋白低剂量组（40 mg/kg）、麦胚球蛋白中剂量组（80 mg/kg）、麦胚球蛋白高剂量组（160 mg/kg）以及维生素C 组（80 mg/kg），每组6 只。末次给药12 h 后，空白组和麦胚球蛋白组给予等体积的生理盐水，其它各组按60 mg/kg NaNO2进行灌胃，所有剂量都用去离子水配制。动物在整个治疗期间均可自由获取食物和水，无死亡，在最后一次治疗24 h后，用乙醚麻醉后处死大鼠。动物实验方案获得河南工业大学伦理委员批准。

1.5 方法

1.5.1 肝脏指数测定

大鼠眼球取血后立即断颈处死，取肝脏组织，用4 ℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，称质量，计算肝脏指数。

肝脏指数=器官质量（mg）/体重（g）

1.5.2 肝匀浆制备

取大鼠肝组织块放在预冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干，精确称取0.3 g，按料液比1∶9（g/mL）加入生理盐水，在冰浴上用剪刀剪碎后，放入匀浆管中，用组织匀浆机制成10%匀浆，3 500 r/min 离心15 min，取上清液待测。

1.5.3 血清生化指标检测

实验结束后，每只大鼠眼球取血，3 000 r/min 离心10 min，分离血清，用全自动生化分析仪检测血清谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）以及谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的活性。

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1.5.4 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定

按文献[14-15]等的方法，取2 mL 磷酸盐缓冲液（空白组）、粗酶液（样品组），加入2 mL NBT 反应液，均匀照光3 min～5 min，以加入缓冲液的不照光的反应液作为空白对照，于560 nm 波长测定吸光度。以（A空白-A样品）/A空白×100 表示抑制率（%），SOD 活力以抑制NBT 光还原的50%为一个酶活单位。

1.5.5 谷胱甘肽（gluthione，GSH）的测定

采用文献[16-17]等的方法，取10%肝匀浆0.5 mL，加入0.5 mL 4%磺基水杨酸，3 000 r/min 离心10 min，取上清液0.5 mL，加入4.5 mL DTNB，混匀后室温25 ℃放置10 min，423 nm 波长处测定吸光度，空白管加入同体积4%磺基水杨酸调零。在标准曲线上查出GSH浓度值，即可计算出原样品中GSH 的含量。

1.5.6 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定

参考文献[18]等的方法，取0.1 mL 10%肝匀浆，加入0.2 mL 8.1%SDS，再加入1.5 mL 0.2 mol/L 乙酸盐缓冲液，最后加入0.8%TBA，迅速混合，避光沸水浴1 h 后，流水迅速冷却，于532 nm 波长处测定吸光度。标准管中以40 nmol/L 四乙氧基丙烷代替肝匀浆，空白组以蒸馏水代替肝匀浆，其它操作同样品管。

1.5.7 肝组织病理学检查

将大鼠肝左叶部位的肝组织块放入10%的多聚甲醛中固定，经过酒精脱水和石蜡包埋后，苏木晴-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，200 倍光镜下观察肝脏组织病理学变化。

1.6 统计方法

2 结果与分析

2.1 亚硝酸盐急性中毒大鼠前后一般情况观察

各组大鼠在染毒前饮食、饮水，活动正常，毛色平整、光泽。染毒后，活动明显减少，表现为呆滞无神或静卧不动，尤其以模型组为主，蜷卧聚团，活力下降，呼吸明显加快、加深，尾巴颜色明显变黑。与模型组相比，麦胚球蛋白低、中、高剂量组、维生素C 组饮食、饮水尚可，精神状态较好，活动增多。

2.2 麦胚球蛋白对亚硝酸盐急性中毒大鼠血清中ALT、AST、LDH 活性以及肝脏指数的影响

麦胚球蛋白对血清中ALT、AST、LDH 活性以及肝脏指数影响结果见表1。

表1 大鼠血清中ALT、AST、LDH 活性以及肝脏指数变化Table 1 Effect of ALT，LDH，AST activities in serum and liver index from rats

模型组大鼠肝脏指数和血清中ALT、LDH 以及AST 活性均显著高于空白组（p＜0.05），且具有统计学意义，表明一次过量亚硝酸盐中毒会导致肝功能出现异常。而相比于模型组，维生素C 组和麦胚球蛋白各剂量组大鼠肝脏指数、ALT、LDH 以及AST 的活性均显著下降（p＜0.05），其中，麦胚球蛋白高剂量组大鼠血清LDH 和AST 活性下降程度最大，表明给予麦胚球蛋白可以有效降低亚硝酸盐对肝脏造成的损害。

2.3 麦胚球蛋白对亚硝酸盐急性中毒大鼠肝脏中SOD 活性、GSH 以及MDA 含量的影响

麦胚球蛋白对血清中SOD 活性、GSH 以及MDA含量的影响见表2。

与空白组相比，模型组大鼠肝脏SOD 活性和GSH含量均显著降低，MDA 含量显著升高，表明亚硝酸盐中毒引起肝脏抗氧化能力下降，脂质过氧化水平增加，诱导氧化应激产生。然而，与模型组相比，麦胚球蛋白低、中、高剂量组以及维生素C 组SOD 活性和GSH含量显著升高（p＜0.05），MDA 含量显著降低（p＜0.05）；其次，麦胚球蛋白各剂量组还增加了GSH 含量（p＜0.05）。结果表明麦胚球蛋白能提高肝脏的抗氧化能力，降低脂质过氧化水平，有效预防氧化应激的发生。

表2 大鼠肝脏中SOD、GSH 以及MDA 水平变化Table 2 Effect of SOD，GSH and MDA activities in liver from rats

2.4 病理切片分析

大鼠肝脏组织病理学变化见图1。

空白组肝细胞整齐排列，细胞核呈椭圆形，细胞正常；模型组肝细胞出现肝细胞变性、坏死、肿胀严重，具有明显炎症损伤。麦胚球蛋白组和空白组无异。低剂量组中肝细胞肿胀严重，在中央静脉周围有明显炎症，细胞核形状不规则；中剂量组中央静脉周围仍有炎症损伤，肿胀范围减小，程度减轻；高剂量组中肝细胞排列整齐，只有少数肝细胞肿胀，未见明显细胞变性及坏死；阳性对照组中，肝细胞结构及肝索排列基本接近正常，细胞核形状规则，肝细胞轻微肿胀。

图1 大鼠肝脏组织病理学变化（200×）Fig.1 Histopathologic changes of liver in rat（200×）

3 结论与讨论

本实验结果显示，一次性灌胃60 mg/kg 亚硝酸盐，可造成严重肝组织细胞损伤，而麦胚球蛋白预处理可明显提高肝组织抗氧化酶活性，降低脂质过氧化程度，减少肝组织炎症，改善亚硝酸盐导致的急性肝损伤。本研究之所以选择60 mg/kg 亚硝酸盐作为中毒剂量，是根据课题组之前做的预实验；其次，相关文献中也报道了60 mg/kg 的亚硝酸盐剂量不会造成大鼠死亡，但是会引起大鼠中毒[19]。

国内外研究发现，亚硝酸盐在体内与自由基反应生成过氧化亚硝酸盐，这会进一步导致细胞组织和结构受损[20]。肝脏在维持健康方面发挥着重要的作用，ALT 和AST 是存在于肝细胞内的酶，当肝细胞被破坏时，ALT 和AST 都会流入到血液当中，因此ALT 和AST 的活性是判断肝损伤的指标[21]。乳酸脱氢酶是机体糖酵解途径的一种重要氧化还原酶，当组织器官缺氧或损害时，LDH 会发生显著变化，这对判断肝损伤程度具有重要意义[22]。SOD 和GSH 是体内抗氧化系统的主要成分，大鼠在亚硝酸盐急性中毒情况下，活性氧自由基产生将增加，机体则会通过SOD 和GSH 等对活性氧自由基进行清除。其中，SOD 是体内的一种重要抗氧化酶，具有明显的抗脂质过氧化以及自由基清除等作用，可将超氧阴离子自由基转化为H2O2[23]。另外，GSH 是非酶体系的重要抗氧化剂和自由基清除剂，与体内自由基结合，维护机体氧化平衡[24]。本实验结果显示，麦胚球蛋白低、中、高剂量组以及阳性对照组（维生素C 组）预处理都可以明显提高大鼠肝脏SOD 活性和GSH 含量，能够快速增强亚硝酸盐中毒大鼠肝脏对活性氧的清除能力，从而发挥保护细胞的作用。其可能机制涉及到抑制NO 产生，减轻亚硝酸盐诱导的氧化应激，恢复肝组织中的SOD 活性来阻断亚硝酸钠的抗氧化活性，对肝损伤具有保护作用[25]。

从病理切片观察可以看出，模型组中肝细胞中央静脉扩大，肝索排列紊乱，肝细胞明显肿胀，与模型组相比，麦胚球蛋白各剂量组肝细胞肿胀减少，炎症减退。病理切片显示的情况和各项指标的测定结果相符合，进一步说明麦胚球蛋白可以有效保护肝细胞，提高肝细胞对亚硝酸盐中毒的抵御能力。

综上，麦胚球蛋白对亚硝酸盐急性中毒肝损伤有保护作用。因此，在预防和治疗亚硝酸盐中毒方面具有一定应用前景。