富集有核细胞法制备肺癌胸腔积液细胞块中EGFR基因突变的检测*

刘萌萌，孔天东，魏 丽，刘 鹏，刘兴华，乔森焱

(郑州市第三人民医院病理科，郑州 450000)

原发性肺癌是导致人类死亡最主要的恶性肿瘤之一，且发病率较高，严重危害人类的身体健康。非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)占原发性肺癌的80%～85%，且5 a生存率小于15%[1]，30%～40%的患者就诊时已属于局部晚期或已发生远处转移[2]。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，肿瘤发病机制在细胞及分子水平上有了进一步认识，NSCLC患者存在表皮生长因子受体(EGFR)突变，应用表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗NSCLC取得了一定疗效，为失去手术机会或不能耐受手术的患者提供了新的有效治疗手段[2]。但是，由于晚期肺癌患者往往已经失去手术机会，获取病理诊断及指导治疗的肿瘤组织标本难度较大，因此寻求对患者无损伤且能获取有效肿瘤标本的途径，对明确病理诊断、指导后续治疗及判断预后十分重要。在实际工作中，约15%的初诊患者及10%～50%晚期肺癌患者常并发胸腔积液，尤其是外周型腺癌患者[3-4]，人们可以利用胸腔积液细胞离心沉渣来获取肿瘤细胞，用于肿瘤的诊断和治疗，但是传统的沉渣包埋由于大量的红细胞及炎症细胞致使有效的肿瘤细胞量较少，不能满足肿瘤的诊断和治疗，更无法满足基因检测的需要。本研究应用富集有核细胞层沉淀法制备胸腔积液细胞沉渣，探讨其应用在肿瘤诊断、分子生物学检测中的意义。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2015年1月—2019年12月于郑州市第三人民医院诊治的NSCLS伴恶性胸腔积液患者116例,其中男45例,女71例,年龄38～81岁,中位年龄61岁；吸烟45例，不吸烟71例；病理类型：腺癌83例，非腺癌33例。

1.2 仪器与试剂 Nano Drop 2000分光光度计(美国Thermo Scientific公司)；ABI 7500荧光PCR仪，莱卡自动免疫组化机。通用型莱卡二抗检测试剂盒(莱卡公司)；一抗Syn、CD56、P40、CK7、Napsin-A、TTF-1、E-Cadherin、CR及WT-1均由福州迈新生物制剂有限公司提供(即用型抗体)；FFPE DNA提取试剂盒及人类EGFR基因突变检测试剂盒由厦门艾德公司提供。

1.3 方法

1.3.1 检测方法 (1)富集有核细胞层沉淀法胸腔积液细胞沉渣制备：按参考文献[5-6]进行，取60 mL胸腔积液标本，倒入尖底离心管中，以14 000 r·min-1离心15 min；用移液器将上清液和红细胞层之间的白细胞层移至新的尖底离心管内后，加入体积分数为4%的甲醛水溶液6 mL，吹打均匀，若细胞量少，可以按以上方法再次制备有核细胞层，静置30 min，以2 000 r·min-1离心5 min，去上清，质量分数0.45%的低渗生理盐水加至50 mL，加入0.5 mL质量分数为1%的冰醋酸，静置5 min，以3 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入体积分数95%乙醇静置20 min，弃上清，取沉渣用滤纸包裹，常规固定、脱水、透明、石蜡包埋、切片(厚3～4 μm)。沉淀法制备的细胞片及石蜡切片进行常规HE染色，显微镜观察是否有癌细胞存在。(2)胸腔积液细胞沉渣的免疫组化检测方法：采用全自动免疫组化机进行，主要步骤：切片脱蜡至水，在室温下3%H2O2封闭内源性过氧化物酶30 min；一抗室温孵育24 min；标记二抗室温孵育20 min，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封固。PBS代替一抗为空白对照，用已知阳性的组织作为阳性对照。(3)ARMS 法检测 EGFR 基因突变：①标本采集与DNA提取、浓度及质量的检测：细胞块标本切片厚5 μm，数量≥10张。病理切片直接用干净的镊子转移至洁净的1.5 mL 离心管中。应用石蜡包埋组织(forma1in fixed and paraffin embedded tissues，FFPE)样品 DNA 提取试剂盒(离心柱型)按照说明书进行DNA提取，DNA样本经Nano Drop 2000分光光度计定量，DNA浓度≥2 ng·μL-1，DNA和蛋白质含量的比值(OD260/OD280)在1.6～2.0，否则视为不合格DNA 样本。②采用突变特异性ARMS法，ABI7500荧光PCR仪，应用厦门艾德生物公司的人类EGFR 基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)，检测EGFR基因18～21外显子的7种热点突变，分别为18外显子(G719x)、19外显子缺失、21外显子(L858R及L861Q)及20外显子(T790M、S768I及插入)。实验操作按照试剂盒说明书进行：向42.3 μL待测样品DNA中加入2.7 μLTaq酶，混匀后取5 μL加入8联管，并进行程序扩增，60 ℃时收集荧光信号。

1.3.2 结果判定 免疫组织化学结果的判定为在高倍镜下观察靶细胞是否阳性。为避免误差，分别由两名高年资病理诊断医师双盲判定结果。阳性着色部位：NapsinA、CK7、CR及Syn为细胞膜/胞质；WT-1、TTF-1及P40为细胞核；E-Cadherin为胞膜/胞质；CD56为胞膜。明确肺肿瘤的组织类型。EGFR的突变结果判断:实验步骤按说明书进行,每次实验均设定对照及阳性对照，以阳性对照及内控结果作为参照,确定各个样品反应管的突变Ct值及外控Ct值。ΔCt值=突变Ct值-外控Ct值。根据突变Ct值,把样品检测结果分为阴性、弱阳性及强阳性。阴性：Ct≥28；阳性：Ct<26；可疑阳性：26≤Ct<28。另外需计算ΔCt值,当ΔCt<10,为突变阳性,反之则为阴性。

2 结果

2.1 免疫组化检测 应用免疫组化检测富集有核细胞层沉淀法制备的肺癌患者胸腔积液细胞沉渣块，明确肿瘤组织类型：CK7、NapsinA及TTF-1阳性明确诊断为肺腺癌83例，P40阳性诊断为肺鳞状细胞癌27例，其他类型6例。

2.2 EGFR 基因在肺癌组织类型中的突变情况 在116 例NSCLC标本中应用ARMS法检测EGFR基因突变，共检测出59 例EGFR基因突变,阳性率为50.86% (59/116)。其中83例肺腺癌患者中48例存在EGFR基因突变，突变率为57.83%，33例非腺癌患者中11例存在突变，突变率为33.33%，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。59例EGFR基因突变中，19外显子缺失27例(45.76%)，21外显子(L858R 及L861Q)突变25例(42.37%)，19外显子缺失和21外显子L858R 双突变5例(8.47%),18外显子(G719x)突变2例(3.40%)，未检测到20外显子(T790M、S768I及插入)突变。

表1 NSCLC组织类型与EGFR基因突变间的关系

2.3 EGFR基因突变与NSCLC临床病理特征的关系 116例NSCLC患者中，59例存在EGFR基因突变，其中女性阳性率高于男性，差异有统计学意义(P<0.001)；59例基因突变患者中，不吸烟患者阳性率高于吸烟患者，差异有统计学意义(P<0.001)；≤66岁患者与>66岁患者年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 NSCLS患者一般资料与EGFR基因突变间的关系

3 讨论

原发性肺癌的发病率占我国十大恶性肿瘤之首,且病死率多年来居高不下[1]。NSCLC中30%～40%患者就诊时已属于局部晚期或发生远处转移，失去手术机会。由于多数老年患者就诊时已无法手术或无法耐受手术，患者的支气管镜取材标本量少或因某些肿瘤解剖位置及身体的基础疾病而不适合手术或穿刺、细针及粗针穿刺活检风险大、反复取材患者耐受程度低等原因，获取诊断及指导治疗的肿瘤组织难度较大，影响了肿瘤的明确诊断和后续治疗。但由于15%的初诊患者及10%～50%晚期患者常并发胸腔积液，尤其是外周型腺癌患者[3]，为肺癌的诊断和治疗提供了新的标本获得途径。

胸腔积液沉渣包埋可为基因检测提供有效的标本来源[7-8]。孟加榕等[9]研究证实，胸腔积液离心的沉淀细胞块和肿瘤组织的EGFR基因突变具有较高一致性；赵士伟等[10]研究表明，对失去手术机会而难以获得组织标本的晚期NSCLC患者，可应用ARMS方法选择胸腔积液细胞块标本筛查EGFR基因突变；丌崇东等[11]研究也显示，细胞块的NSCLC患者EGFR基因突变率略高于组织块，提示具有转移性的NSCLC患者有更高的EGFR基因突变率。但是和组织标本相比，胸腔积液中的肿瘤细胞数量相对偏低，导致获取的DNA浓度少，推测可能在制备细胞块的过程中，标本经中性福尔马林溶液的固定造成核酸与蛋白质之间发生交联反应，增加了DNA提取的难度；在浸蜡和包埋过程中又造成DNA片段化，同时又增多了核酸的甲基化修饰，这些原因降低了DNA的提取率。另外，胸腔积液中含有大量的红细胞，在离心沉淀后，使肿瘤细胞密度相对偏小，这也导致DNA提取的浓度偏低。因此，寻求新的细胞沉渣包埋的方式，得到有效的标本是首要解决的问题。2017年禹乐等[5]采用富集有核细胞层沉淀法制备细胞沉渣，在本实验中采用并优化了该方法，利用高速离心对不同密度的细胞进行分离，同时使用冰醋酸溶解部分红细胞，制备细胞沉渣块，残存的红细胞位于离心管的最底层，有核细胞的密度次之，介于红细胞层与上清液之间，这样制备的细胞沉渣块中因红细胞较少而背景清楚，肿瘤细胞分布均匀，成团脱落的肿瘤细胞组织结构保存较完整，肿瘤细胞核浆对比清晰，染色清晰，满足了病理诊断及分子病理的相关检测所需要的标本量，并获得了较满意的结果。

该技术对肿瘤后续进行基因突变检测或测序工作提供了强有力的支持。EGFR基因突变是EGFR-TIK治疗的理想靶点及疗效预测指标[12]，尤其对晚期NSCLC患者，EGFR-TIK已经成为此类疾病的一线治疗方案[4]。在肺癌中，EGFR总突变率为20%～45%，其中19外显子、21外显子突变率为85%～90%。亚洲非吸烟女性患者几乎都有EGFR基因19外显子的突变[13]，EGFR基因20外显子的突变率为1.6%(占EGFR所有突变类型的9%)；约50%的NSCLC患者可产生耐药性，由第20外显子上的T790M位点发生突变引起；第21外显子的位点突变率为25%～33%，主要为L858R，这与厄洛替尼、阿法替尼的用药敏感性相关[14]，但较19外显子突变的患者敏感性偏低。本实验中116例NSCLC细胞沉渣包埋组织块标本中应用ARMS法检测的EGFR基因突变阳性率为50.86%，略高于以往的研究，可能与有核细胞层沉淀法制备细胞沉渣块有效消除了背景中的红细胞及纤维性蛋白成分，从而提高了肿瘤细胞的密度，同时和胸腔积液中癌细胞的EGFR突变率高于原发肿瘤有关[15]，也可能与本组病例中腺癌患者所占比率较大有关。EGFR突变中，存在19外显子缺失、21外显子(L858R及L861Q)突变和18外显子(G719x)突变，未检测到20外显子(T790M、S768I及插入)突变。在NSCLC组织学类型中，肺腺癌的EGFR突变率高于非腺癌的突变率，和杨新等[15]报道的肺腺癌EGFR基因的突变率基本一致。在临床特征方面，女性较男性EGFR基因突变率高；不吸烟患者较吸烟患者基因突变率高；年龄差异不明显。

综上所述，胸腔积液离心细胞块沉淀法解决了脱落细胞无法进行连续切片和免疫组化检测的问题，具有重要的临床价值。同时，应用细胞沉渣块检测EGFR基因突变，避免了穿刺活检给患者带来的痛苦，也为无法手术及不能耐受手术的患者提供了有效的基因检测途径，对晚期NSCLC患者进行靶向药物治疗具有重要指导意义。本研究应用富集有核细胞层沉淀法制备胸腔积液细胞沉渣组织块较传统的离心细胞沉渣，有效提高了肿瘤细胞的获得率及DNA提取率，为肺癌患者的诊断、治疗及分子生物学检测提供了新的有效方法和手段。