连城白鸭与沔阳麻鸭胸肌转录组比较

陈 星，杨 宇，龚 萍，叶胜强，邓 兵，凌明湖，杜康裕，王丽霞

（武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉 430208）

鸭肉胆固醇含量低，不饱和脂肪含量高，是绿色健康的肉类产品，深受消费者喜爱。我国地方鸭品种丰富，其中原产于福建地区的连城白鸭呈现独特的“乌嘴白羽”外貌特征，具有重要的滋补和药用价值，被称为我国“唯一药用鸭”[1]；沔阳麻鸭是湖北优秀地方鸭品种，该鸭耐粗饲，肉质优良，曾是湖北地区酱卤鸭制品的重要原料[2]。目前，地方品种鸭被广泛作为培育优质肉鸭的遗传素材，如利用连城白鸭和快大型肉鸭杂交选育的肉用型连城白鸭品系[3-4]，利用地方麻鸭和快大型肉鸭杂交的优质肉鸭品系[5-6]。研究不同地方品种鸭的肉质差异以及肉质差异形成的分子机制，对于利用不同地方鸭品种进行鸭肉质遗传改良具有重要意义。随着二代测序技术的不断完善和广泛使用，比较转录组学技术成为研究畜禽肉质形成分子机制的重要工具[7-10]。本研究从转录组水平上探讨连城白鸭与沔阳麻鸭肉质的差异，为更细致深入了解不同地方鸭的肉质特性提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 连城白鸭和沔阳麻鸭在相同条件下网床饲养至300 日龄，每个品种随机挑选3 只母鸭，禁食6 h后活体称重，屠宰取样。

1.2 肉质性状测定 所有鸭取同侧的胸肌组织进行肉质性状测定。参照张亚慧等[11]的方案，利用索氏抽提法对粗脂肪含量进行测定。参照吴莹莹等[12]的方案，利用高效液相色谱法对鸭胸肌组织肌苷酸含量进行测定。将鸭胸肉修剪成长2 cm、宽1 cm、厚1 cm 的长条形，剔除筋腱、脂肪和肌膜，利用FTC 公司食品物性分析仪（型号：TMS-PRO）测定胸肌剪切力。每个样本测定3 次，计算平均值。

1.3 转录组高通量测序、组装及功能注释 采集鸭胸肌样品3～5 g，利用Trizol 进行总RNA 提取。使用Illumina 公司Hiseq X Ten 高通量测序平台对转录组文库进行测序，获得Raw data 后，用Cutadapt 软件截取测序接头引物并使用Trimmomatic 软件过滤原始碱基序列的低质量值数据后获得Clean reads。利用Tophat2，调用bowtie2，将每个样本质控后的二代序列比对至北京鸭参考基因组序列。

1.4 表达水平分析及KEGG 通路富集分析 调用bowtie2的比对结果进行统计，得到每个样品比对到每个转录本上的Reads 数目，并对其进行FPKM（Fragments Per Kilobase per Million bases）转换，来自同一个fragment的paired-end Reads 计数为一个fragment，进而得到基因和转录本的表达水平。用R 语言包edgeR 进行基因表达差异分析，差异表达基因的筛选阈值为|LOG2（Fold Change）|＞1 或，使用Goseq（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html）和KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）软件对差异表达基因（DEGs）进行GO 和KEGG 的富集分析。

1.5 差异表达基因荧光定量PCR 验证 为验证高通量测序结果的准确性，挑选6 个差异表达基因AFBP、AMPD1、PLIN2、AQP7、ATG1、EDNRB2，参照GenBank中公布的鸭基因序列，利用Primer Primier 5.0 软件设计特异性引物（表1），引物由武汉擎科生物技术有限公司合成。以1.3 中各样品RNA 为模板逆转录后进行实时荧光定量PCR，测定差异表达基因相对表达量。

1.6 统计分析 肉质性状测定数据采用平均值± 标准误来表示，数据利用SPSS22.0 统计软件采用单因素方差分析比较差异显著性。P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。基因相对表达量采用2-ΔΔCt法进行统计分析。

2 结果

2.1 300 日龄连城白鸭和沔阳麻鸭肉质性状比较 由表2 可知，300 日龄连城白鸭体重极显著低于沔阳麻鸭。2个品种胸肌率、胸肌粗脂肪率、胸肌剪切力均无显著差异，但连城白鸭胸肌肌苷酸含量显著高于沔阳麻鸭。

2.2 测序数据评估及对比分析 经过文库质量检测和测序质量控制，各样品均符合测序要求。6 个样品共得到40.6 Gb Clean Data，各样品Clean Data 均达到6.2 Gb以上，获得Clean reads 22 193 765～26 261 968 条。测序数据碱基质量值Q30 为93.4%～94.2%，碱基GC 含量为51.3%～52.3%，各碱基质量稳定在20%～30%，低质量碱基比例小，表明文库构建质量和测序质量高，测序数据准确可靠，满足后续分析条件。将获得的Clean reads 与北京鸭参考基因组进行对比分析，结果表明各样品的Clean reads 与参考基因组的比对效率在68.65%～72.17%。

表1 实时荧光定量PCR 引物信息

表2 连城白鸭和沔阳麻鸭肉质指标比较

2.3 DEGs 的筛选、功能注释和GO 富集分析 根据差异基因筛选标准，获得了连城白鸭与沔阳麻鸭胸肌的DEGs 2 333 个，其中麻鸭高表达基因1 060 个，连城白鸭高表达基因1 273 个。部分差异表达基因信息见表3。

筛选出的2 333 个差异表达基因中，2 024 个基因能被GO 数据库注释，GO 分类结果见图1。被注释的DEGs 分别参与了生物学过程（Biological Process）、细胞组分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）的27、17、11 个功能亚分类。在生物学过程分类中，细胞过程、单一的生物过程和代谢过程参与的DEGs 最多。在细胞组分分类中，参与细胞、细胞部分、细胞器的差异表达基因数量最多。在分子功能分类中，DEGs 主要参与了结合和催化活性等功能。

2.4 差异表达基因的KEGG 注释 经过分析，1 060 个基因在麻鸭中表达较高，1 273 个基因在连城白鸭中表达较高。这些差异表达基因共富集到280 条信号通路，差异显著的67 条，部分通路见图2。差异表达基因富集到的代谢通路方面，脂质代谢有15 条，氨基酸代谢有12 条，碳水化合物代谢有14 条，维生素代谢有12 条。蛋白质、脂肪、碳水化合物和氨基酸等是肌肉的重要组成，这些物质代谢差异直接影响了肌肉物质的构成和品质。

连城白鸭中高表达基因主要富集到雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、免疫调节相关的一些信号通路，如细胞坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、Toll 样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、TPR 通道炎症介导调节通路（Inflammatory Mediator Regulation of TRP Channels）以及凋亡自噬相关的一些信号通路（表4）；麻鸭高表达基因主要富集到与蛋白质消化吸收（Protein Digestion and Absorption）、维生素和氨基酸代谢相关的信号通路，如酪氨酸代谢通路（Tyrosine Metabolism）、维生素B5代谢通路（Vitamin B6 Metabolism）以及视黄醇代谢通路（Retinol Metabolism）等（表5）。

2.5 Real-time PCR 验证测序 6 个基因（转录本）的qRT-PCR 验证结果见表6。选择的目的基因在2 个鸭品种间表达变化与转录组测序的结果一致，表明本研究利用转录组测序获得的差异表达基因较为准确。

3 讨 论

地方品种鸭肉质鲜嫩、无腥味。本研究结果显示，300 日龄连城白鸭体型较沔阳麻鸭小，但二者胸肌率无显著差异；2 个品种鸭胸肌剪切力无显著差异；2 个品种300 日龄肌内脂肪均在3.8%左右，无显著差异。有报道显示，连城白鸭肌苷酸含量显著高于大型肉鸭[13]，本研究测定发现，连城白鸭肌苷酸含量也显著高于沔阳麻鸭，提示连城白鸭在风味物质沉积方面具有显著优势。这可能是连城白鸭适合煲汤的重要原因。从2 个品种鸭差异表达基因富集到的通路进一步比较其物质沉积方面的差异，有助于寻找影响地方鸭风味和药用价值形成的营养物质。

表3 连城白鸭与沔阳麻鸭胸肌组织部分差异表达基因

图1 差异表达基因GO 注释

3.1 连城白鸭和沔阳麻鸭脂肪代谢相关信号通路比较脂肪细胞脂类分解调节信号通路（Regulation of lipolysis in adipocyte）中，PLIN1、FABP4等脂类转运相关的基因在沔阳麻鸭中显著高于连城白鸭，FABP4基因多态性与鸭胸肌肌内脂肪含量以及其中硬脂酸、亚油酸和亚麻酸的含量呈显著相关[14]。虽然本实验测定的连城白鸭和沔阳麻鸭胸肌粗脂肪含量无显著差异，但不同类型脂肪酸含量还需更细致的比较。腺苷酸活化蛋白激酶信号通路（AMPK Signaling Pathway）是肌肉能量代谢的关键信号通路，能被脂联素激活。脂联素基因多态性和鸭脂肪沉积显著相关[15]。本研究中，脂联素基因ACDC在沔阳麻鸭中表达显著高于连城白鸭，但脂联素受体基因ADIPOR2仅在连城白鸭胸肌组织中检测到表达，沔阳麻鸭中脂联素是否通过其他受体发挥作用还需进一步研究。

3.2 连城白鸭和沔阳麻鸭胸肌鲜味物质代谢通路比较本实验测定结果显示连城白鸭胸肌肌苷酸含量较沔阳麻鸭高。肌苷酸在动物体内可从头合成，也可由游离嘌呤或嘌呤核苷经简单步骤合成。转录组未发现肌苷酸相关代谢通路在2 个品种间存在差异，仅发现肌苷酸合成相关的酶基因AMPD1在2 个品种间表达有显著差异。AMPD1 是动物肌肉中由ATP 经AMP 生成IMP 的关键酶。报道显示，AMPD1易发生变异[16-18]，但其与鸭肉肌苷酸含量相关性还未见报道，值得进一步研究。

图2 差异表达基因KEGG 信号通路富集散点图

表4 连城白鸭高表达基因显著富集的15 条信号通路

3.3 连城白鸭和沔阳麻鸭胸肌黑色素合成信号通路比较 连城白鸭呈现出“乌嘴乌脚”的外貌特征。转录组分析显示，连城白鸭和麻鸭胸肌黑色素合成通路（Melanogenesis）呈现显著差异。连城白鸭胸肌中多个黑色素合成关键基因表达显著高于沔阳麻鸭，如EDNRB2、MITF、KITLG基因。MITF是调控黑色素细胞发育的关键转录因子，最近发现其变异可能是导致北京鸭白羽性状的关键[19]，MITF在连城白鸭中差异表达可能导致不同部位的黑色素含量呈现显著差异[20-21]。EDNRB2基因变异也会影响鸭羽毛中黑色素沉积[22]。KITLG编码cKIT 激酶配体介导KITLG/cKIT，人KITLG基因突变会引起皮肤色素沉积异常[23]，表明连城白鸭体内存在更多的黑色素沉积，连城白鸭乌嘴乌脚外观特征可能和这些基因高表达有关。药物本草中记载，乌骨鸡药用价值与皮肤和肌肉等组织中黑色素相关，连城白鸭中药用价值是否与黑色素含量相关还需要进一步研究。

表5 麻鸭高表达基因显著富集的15 条信号通路

表6 测序结果的qRT-PCR 验证

3.4 连城白鸭和沔阳麻鸭药类物质代谢通路比较 连城白鸭药物代谢相关通路（Drug metabolism-cytochrome P450）中MAOA、AOX、GST等基因表达显著低于麻鸭，表明连城白鸭对体内药类物质代谢能力较弱，有助于药类物质在体内沉积。

牛磺酸具有清热解毒的作用[24]，与连城白鸭的药用价值较符合。陶正清[25]测定了鸭肉中19 种游离氨基酸，其中牛磺酸含量最高。动物体内牛磺酸一部分来自外源食物摄入，一部分在肝脏中通过蛋氨酸和半胱氨酸代谢的中间产物合成。本实验中虽然2 种鸭胸肌组织中牛磺酸代谢通路（Taurine and Hypotaurine Metabolism）差异不显著，但牛磺酸生物合成关键限速酶半胱亚磺酸脱羧酶基因CSAD在连城白鸭中表达显著高于麻鸭，而牛磺酸分解相关的γ-谷氨酰转肽酶基因GGT在连城白鸭中表达显著低于麻鸭，提示牛磺酸可能更容易在连城白鸭体内沉积。有报道显示连城白鸭牛磺酸含量达1.151%[1]，远高于报道的猪牛鸡肉0.03%～0.38% 的牛磺酸含量[26]。因此，连城白鸭中牛磺酸合成代谢规律值得进一步研究。

4 结 论

连城白鸭和沔阳麻鸭都属于优质地方鸭品种，本研究通过比较连城白鸭和沔阳麻鸭胸肌肉质指标和转录组，发现2 个品种肉质存在一定差异。2 个品种胸肌脂肪、肌苷酸、氨基酸（赖氨酸、酪氨酸等）、维生素（A、B6等）、黑色素等信号通路都存在显著差异，重要的物质合成和代谢相关基因，如ACDC、FABP4、AMPD1、MITF、MAOA、CSAD作为地方鸭品种风味营养物质沉积相关候选基因值得进一步研究。