猪脂肪沉积相关酶基因表达与胴体及肉质性状的相关性研究

2021-03-15史开志陈大军黄明捷莫先艇王天松

中国畜牧杂志 2021年3期

郭勇，张雄，史开志，陈大军，黄明捷，莫先艇，王天松，张勇*

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；3.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550005；4.赫章九龙农业旅游开发有限公司，贵州赫章 553200）

猪肉的口感受遗传、营养、屠宰和加工工艺等多种因素影响，量化为肌肉pH、肉色、肌内脂肪（Intramuscular Fat，IMF）、肌肉水分、嫩度、多汁性、风味评分等指标，其中IMF 含量的高低往往能影响人们对肉产品的选择，国外品种经过多年选育，其IMF含量仍不及多个国内地方猪种[1]。研究表明，脂肪沉积包括脂肪的合成、转运和分解等过程，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliFerator-activated receptorγ，PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase，LPL）和乙酰辅酶A 羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）是参与合成脂肪的关键酶，脂肪甘油三酯脂酶（Adipose triglyceride lipase,ATGL）属于脂解酶，均为对动物脂肪沉积具有调控作用的重要基因[2-5]。猪脂肪细胞有前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞2 种类型，前体脂肪细胞由PPARγ等早期转录因子调控分化为成熟脂肪细胞，脂肪的存在形式主要是甘油三酯，由脂肪酸被组织酯化合成，脂肪酸可由摄入体内的葡萄糖在ACC 等酶的作用下所转化，或是血液中乳糜微粒和极低密度脂蛋白所携带的甘油三酯被LPL 分解成甘油和脂肪酸[6-8]。ATGL是参与脂肪代谢的重要酶之一，其将脂肪组织中甘油三酯水解以调控细胞中脂肪酸与甘油的平衡[9]。

柯乐猪作为贵州省优质地方猪种，属于乌金猪支系，具有中等偏大体型，较大且呈漏斗状的腹部，具有抗病力和抗逆性较强的特点，能较好地适应贵州喀斯特地区湿冷复杂的养殖环境[10]。野柯F1代猪已于2017年注册为“夜郎黄金猪”商标，以黄毛系柯乐猪为母本、野猪为父本，其杂交后毛色呈金黄色，肉品质优良，具有耐粗饲、耐牧、肉质鲜香、低背膘厚等特点。本研究选用柯乐猪×野猪F1代杂交猪作为研究对象，通过测定其胴体及肉质性状指标，并与脂肪沉积相关酶基因的表达水平进行关联分析，以期为柯野杂交猪脂肪沉积效应遗传分析提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物随机选取5 头全同胞柯乐猪×野猪F1代，于赫章九龙农业旅游开发有限公司夜郎黄金猪养殖场饲养至10 月龄。宰前禁食12 h，屠宰后取背最长肌和皮下脂肪组织样品，冻存于液氮中带回实验室，于-80℃冷冻保存。

1.2 主要试剂及仪器 Trizol 购自（大连）宝生物公司；逆转录试剂盒（Thermo ScientiFic RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis）、荧光染料（2×RealStar Green Fast Mixture with ROX）购自贵州西宝生物公司；核酸染料、无酶水（RNase-Free water）、无水乙醇、异丙醇、DL2000 DNA marker 等均购自北京鼎国生物技术有限公司。电子天平购自德国赛多利斯公司；游标卡尺购自日本三丰（mitutoyo）公司；C-LM3B 型数显嫩度仪购自北京天翔飞域仪器设备有限公司；CR-400 型色差仪购自日本柯尼卡美能达公司；Soxtec2055 型全自动索氏抽提仪购自丹麦福斯公司；CFX96 实时定量PCR 仪购自Bio-Rad 公司。

1.3 测定指标各项胴体、肉质性状指标参照中华人民共和国农业行业标准《瘦肉型猪胴体性状测定技术规范》（NY/T 825-2004）、《猪肌肉品质测定技术规范》（NY/T 821-2004）进行测定。

1.4 总RNA 的提取及cDNA 的逆转录通过Trizol 法提取背最长肌和皮下脂肪组织RNA，并通过紫外分光光度计检测其浓度和OD 值。参照逆转录试剂盒对RNA 进行逆转录，将合成后的cDNA 置于-20℃备用。

1.5 引物设计参考GenBank 上猪（Sus scroFa）PPARγ、LPL、ACC、ATGL、GAPDH基因序列，使用Primer 5.0软件进行引物设计，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，基因引物序列见表1。

表1 PPARγ、LPL、ACC、ATGL、GAPDH 基因序列

1.6 实时荧光定量PCR 反应使用Bio-Rad 公司CFX96 实时定量PCR 仪进行定量分析，以GAPDH 基因作为内参，对单个样品设置3 个重复。实时荧光定量体系采用20 µL：2×RealStar Green Fast Mixture with ROX 10 µL、正反向引物（10 μmol/L）各0.5 µL、cDNA模板1 µL、RNase-Free H2O 8 µL。反应条件采用两步法PCR 扩增标准程序：95℃预变性2 min，95℃变性15 s、退火30 s、72℃延伸30 s 共35 个循环，72℃终延伸2 min。

1.7 统计分析运用Excel 2016 软件对各组织中目的基因和内参基因mRNA 表达量进行处理，运用2-ΔΔCt法计算，结果以平均数± 标准差表示；运用SPSS 26.0软件中Pearson 方法检测背最长肌和皮下脂肪组织中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表达量与胴体肉质性状指标间相关性；通过STRING 在线网站（https://string-db.org/）对各蛋白互作关系进行预测。

2 结果与分析

2.1 胴体肉质测定由表2 可知，柯乐猪×野猪F1代肉质指标中，肌肉水分为71.67 %、肌内脂肪为3.26%、皮厚为3.83 mm、背膘厚为39.30 mm、眼肌面积为37.12 cm2。

表2 柯乐猪×野猪F1代的胴体肉质性状

2.2 胴体肉质性状相关性分析由表3 可知，柯乐猪×野猪F1代pH1h与L*、a*和b*呈现出显著负相关（r=-0.926；r=-0.941；r=-0.929，）；肌肉水分与肌内脂肪间呈显著负相关（r=-0.911）；背膘厚与眼肌面积间呈显著负相关（r=-0.896）。

表3 胴体指标、肉质性状之间的相关性

2.3 常规PCR 扩增结果利用普通PCR 方法进行目的基因片段和内参基因片段扩增，并经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。由图1 可知，PPARγ、LPL、ACC、ATGL和GAPDH引物PCR 扩增产物长度及目的片段与预期片段大小相符，电泳条带清晰、无拖尾、拖带现象，cDNA 和引物可用作后续实验。

图1 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果

2.4 背最长肌和皮下脂肪组织中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表达水平由图2 可知，ACC基因在背最长肌中相对表达量最高，显著高于ATGL基因，其次为LPL基因；在皮下脂肪中相对表达量最高的为PPARγ基因，其次为ACC基因，LPL基因表达最低。

图2 背最长肌（A）和皮下脂肪组织（B）中PPARγ、LPL、ACC、ATGL 基因mRNA 表达水平

2.5 背最长肌组织中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表达量间相关性由表4 可知，在背最长肌组织中4 个目的基因间两两均为正相关关系，其中，PPARγ与LPL基因mRNA 表达量呈现出显著正相关（r=0.890）；LPL 与ACC基因mRNA 表达量呈现出显著正相关（r=0.959）。

表4 背最长肌中PPARγ、LPL、ACC、ATGL 基因mRNA 表达量的相关系数

2.6 皮下脂肪组织中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表达量的相关性由表5 可知，皮下脂肪组织中PPARγ与LPL基因呈负相关，与ACC、ATGL基因mRNA 表达量呈正相关，其中，与ACC基因间呈显著正相关（r=0.887）。

表5 皮下脂肪中PPARγ、LPL、ACC、ATGL 基因mRNA 表达量的相关系数

2.7 背最长肌和皮下脂肪组织中各基因mRNA 表达量与胴体肉质性状之间的相关性由表6 可知，背最长肌组织中4 个基因mRNA 表达量均与肌内脂肪、皮厚和背膘厚呈正相关，与滴水损失、熟肉率、剪切力、肌肉水分和眼肌面积呈负相关，其中PPARγ、LPL基因mRNA表达量均与肌肉水分呈负相关（r=-0.940，r=-0.908，P＜0.05）；在皮下脂肪组织中LPL基因mRNA 表达量与皮厚间呈负相关（r=-0.909，P＜0.05）。

2.8 蛋白互作关系由图3 可知，LPL 蛋白与ATGL（PNPLA2）蛋白间存在蛋白互作，而ATGL 蛋白、PPARγ蛋白和ACC 蛋白两两间均存在着蛋白互作关系。同时，LPL基因和PPARγ基因参与了PPAR 信号通路（PPAR Signaling Pathway），PPARγ与ACC基因参与了AMPK 信号通路（Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase Signaling Pathway）。

图3 PPARγ、LPL、ACC、ATGL 蛋白间互作关系

3 讨论

杂交改良是猪育种重要的实验方法之一，利用不同亲本组合杂交得到的后代可产生杂种优势，以此获得优良的生产性状[11]。相同屠宰体重阶段，柯乐猪× 野猪F1代背膘厚低于纯种柯乐猪（42.4 mm），眼肌面积高于纯种柯乐猪（23.97 cm2），表明地方猪与野猪杂交可有效地降低地方猪皮下脂肪的沉积速率，提高猪瘦肉产量[10]。

研究表明，PPARγ、LPL基因在猪中的mRNA 表达量与肌内脂肪含量呈不同程度的正相关[12-13]，ACC基因和ATGL基因均已在猪中发现，且在脂肪沉积过程中均发挥着不同的作用[14-15]。通过预测各蛋白互作关系，发现LPL 蛋白与ATGL（PNPLA2）蛋白间存在蛋白互作，且ATGL 蛋白、PPARγ蛋白和ACC 蛋白两两间均存在着蛋白互作关系。同时，LPL基因和PPARγ基因参与了PPAR 信号通路，PPARγ与ACC基因参与了AMPK信号通路。PPAR 信号通路主要通过PPARs 与配体结合，激活与视黄醇类X 受体（RXR）的异二聚化，然后与靶基因中的特定DNA 反应元件（PPAREs）结合，转换来自代谢环境的适当信号来控制基因表达，具有调节脂质代谢、代谢稳态和脂肪形成等作用[16]；MAPK 信号通路主要包含经典MAPK 信号通路、JNK/p38MAPK信号通路和ERK5 信号通路，其参与了多种细胞及生长因子活化后的信号转导，具有调节细胞增殖、生长和分化的作用[17]。本研究中，PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因在背最长肌和皮下脂肪组织中均有不同程度表达，背最长肌中相对表达量最高的为ACC基因，显著高于ATGL基因，其次为LPL基因；在皮下脂肪中相对表达量最高的为PPARγ基因，其次为ACC基因，LPL基因表达最低。在背最长肌中LPL与PPARγ、ACC基因表达量呈显著正相关，皮下脂肪组织中PPARγ与ACC基因间呈显著正相关。

表6 背最长肌和皮下脂肪组织中各基因mRNA 表达量和胴体肉质性状之间的相关性

本研究中肌内脂肪与肌肉水分呈显著负相关（r=-0.911），这与在从江香猪中的研究结果相同[13]，同时本研究还发现肌肉水分和LPL及PPARγ基因表达量呈显著负相关。肌肉水分直接影响肉色和嫩度等肉质性状，也关系到肉产品的存储时长[18]。前人研究发现，LPL基因在大围山微型鸡腿肌中的表达显著高于胸肌，而腿肌和胸肌中的肌肉水分含量却刚好相反[19]；在昭乌达羊背最长肌中，PPARγ基因的表达量低于乌拉特羊，但昭乌达羔羊肉的肌肉水分含量高于乌拉特羊[20]。这与本研究中LPL和PPARγ基因表达量与肌内水分间呈显著负相关的结果相同。对16 周龄九龙鹅中ATGL基因mRNA的表达与机体脂肪沉积之间的相关性进行研究发现，ATGL基因mRNA 的表达量与皮下脂肪率呈显著正相关，而与腹部脂肪率、胸肌率、腿肌率、腿肌肌内脂肪率和胸肌肌内脂肪率呈不同程度负相关，表明ATGL基因对九龙鹅在机体脂肪沉积过程中具有一定的调控作用[21]。姚焰础[22]研究发现苏尼特羔羊肌内脂肪含量与ACC基因和LPL基因的mRNA 表达量呈极显著或显著正相关，这与本实验在背最长肌中猪脂肪沉积相关酶基因的表达均与肌内脂肪间呈正相关的结果类似。

此外，本研究发现，LPL基因与皮厚呈负相关。LPL的基因表达是脂肪细胞分化的早期标志之一，限制着血浆甘油三酯的清除率和脂肪酸的组织摄取率[23]。在牛前体脂肪细胞中，过表达或沉默miR-224 时，C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、FASN和PLIN1相对表达量随之降低或上升，而miR-224 靶向LPL基因并存在负调控关系，表明LPL基因对牛前体脂肪细胞的成脂分化具有调控作用[24]。同时在贵州从江香猪LPL基因的内含子4 中存在AFa I 酶切变异位点与皮厚性状指标显著相关[25]，这与本研究中LPL基因与皮厚呈负相关类似，暗示了LPL基因可作为猪脂肪沉积相关重要候选基因。计划下一步将采用细胞培养和细胞转染等技术对脂肪沉积相关酶基因从细胞水平进行研究，进一步了解其在猪脂肪沉积过程中的调控作用。