基于网络药理学探讨消癥活络方通过ERK5通路抗大鼠肝纤维化的机制

田 乐，王颖航，潘 志

1 长春中医药大学 人参科学研究院，长春130117； 2 长春中医药大学附属医院 风湿科，长春130117

肝纤维化是慢性肝损伤后的一种自我修复过程，特征是细胞外基质(ECM)的合成和降解失衡，导致明显的ECM沉积。其原因多种多样，例如肝炎病毒感染，自身免疫性肝病以及酒精性脂肪肝或代谢相关脂肪性肝病[1-2]。肝纤维化最终可能发展为肝硬化、肝衰竭和肝癌，这极大地影响了患者的生存和生活质量[3]。在肝病诱发纤维化因子后，肝星状细胞(HSC)是肝纤维化的主要效应细胞。但是，肝纤维化的分子机制尚待确定，也缺乏有效的药物来防治肝纤维化。

消癥活络方(XZHLF)为作者研究团队的临床经验方[4]，临床效果显著，代东雪等[5]研究表明消癥活络方能够明显改善大鼠肝纤维化程度，其作用机制可能是通过降低TGFβ1的表达，从而抑制HSC的活化，降低ECM的合成。唐成芳等[4]研究表明消癥活络方含药血清能抑制TGFβ1诱导的HSC-T6增殖；消癥活络方可改善肝痹患者的临床症状和相关的生化指标。

随着网络药理学的飞速发展，基于网络药理学的分析成为一种揭示中草药复杂机制的新方法。中药在治疗中具有多组分和多靶标的特点。因此，新方法与中医相结合可以促进研究从单一药物靶标转变为多组分靶标网络[6]。因此，笔者通过网络药理学方法预测了XZHLF抗肝纤维化的潜在作用机制，并在前期评估XZHLF的抗肝纤维化作用的基础上，使用CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型通过体内药理实验进行验证。

1 资料与方法

1.2 XZHLF“药物-活性成分”网络构建 将XZHLF各中药与各中药活性成分相匹配，采用Cytoscape 3.7.1软件构建“药物-活性成分”网络图。

1.3 肝纤维化疾病靶点的获取 通过GeneCards、OMIN数据库，以“Hepatic Fibrosis”为关键词检索，得到肝纤维化疾病靶点，利用韦恩图将2个数据库结果取并集得到肝纤维化疾病靶点的全部信息。

1.4 XZHLF防治肝纤维化潜在作用靶点的获取 将获得的肝纤维化疾病靶点与上述获得的活性成分靶点利用韦恩图取交集，得到XZHLF防治肝纤维化的潜在作用靶点。

1.5 XZHLF防治肝纤维化的“活性成分-潜在作用靶点”网络构建 将XZHLF防治肝纤维化潜在作用靶点与XZHLF各中药活性成分相匹配，采用Cytoscape 3.7.1软件构建“活性成分-潜在作用靶点”网络图。

1.6 KEGG通路富集分析和GO生物过程富集分析 将XZHLF防治肝纤维化的潜在作用靶点的Gene Symbol导入Metascape数据库，进行KEGG通路富集分析和GO生物过程富集分析并保存结果。选取满足P<0.001的通路，并根据富集基因数量降序排序，选取富集基因数最多的前20条，使用微生信网站绘制气泡图。

1.7 “成分-靶点-通路”网络构建 本研究针对前20条KEGG通路中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路进行研究，筛选出富集在MAPK信号通路上的靶点、与这些靶点相应的XZHLF活性成分以及与这些XZHLF活性成分相映射的其他通路，结合上述三者，利用Cytoscape 3.7.1软件构建出“成分-靶点-通路”网络关系图。

1.8 Western Blot法验证XZHLF对细胞外信号调节激酶5(ERK5)通路蛋白表达的影响

1.8.1 动物 SD大鼠，雄性，体质量150～180 g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司[实验动物生产许可证编号：SCXK(吉)-2018-0007；实验动物使用许可证编号：SYXK(吉)2018-0014]。

均质后的料液放入酶解器中，预热至45 ℃后恒温，用20%的氢氧化钠调节pH至7.0～9.0左右，再按2%～5%投料量将重组胰蛋白酶投入(添加胰蛋白酶的目的是利用胰蛋白酶将鳗鱼肉蛋白水解成氨基酸，得到高含钙的复合氨基酸混合液，再经均质、喷雾干燥等工艺生产蛋白钙及蛋白粉产品，通过前期实验研究表明胰蛋白酶对鳗鱼肉的酶解效率高)，搅拌20 min，然后加热至60～80 ℃(10 min),使原料酶解。

1.8.2 仪器与试剂 SK-O180-E水平摇床，大龙兴创实验仪器；165-8000电泳仪，170-3930转膜仪(湿转)，美国Bio-Rad公司；全自动低温离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；酶标仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司；立式鼓风干燥箱，上海和呈仪器制造有限公司。黄芪、穿山甲、鳖甲、钩藤、红景天，北京同仁堂制药集团长春分店；秋水仙碱，云南植物药业有限公司；CCl4(分析纯)，天津致远化学试剂有限公司；植物油，中粮食品营销有限公司；RIPA裂解液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，上海碧云天生物技术有限公司；兔抗大鼠ERK5、p-ERK5和MEKK3多克隆抗体，美国CST公司；兔抗大鼠MEK5多克隆抗体，Abcam公司；ECL发光液，北京全式金生物技术有限公司；

1.8.3 方法 按比例称取所需剂量的中药饮片，按常规水煎法煎煮，最后合并滤液并浓缩(含生药量1.96 g/ml)，4 ℃保存备用。健康SD大鼠60只，随机分为空白对照组(K组)，模型组(M组)，秋水仙碱阳性对照组(Y组)，XZHLF高(G组)、中(Z组)、低(D组)剂量组6组，每组10只。除K组，其余各组大鼠按体质量背部皮下注射40%CCl4油剂3 ml/kg(首次注射5 ml/kg)[7-8]，K组给予等量体积生理盐水，每周二、周五各1次，持续8周。造模同时给药，G、Z、D组按照4.9 g/kg、9.8 g/kg、19.6 g/kg大鼠体质量灌胃给药，Y组按 0.1 mg/kg大鼠体质量灌胃给药，M组和K组按10 ml/kg大鼠体质量灌胃给蒸馏水，每天灌胃给药1次，连续给药8周。给药结束后禁食12 h，取各组大鼠肝组织100 mg，放入预冷的研钵中，液氮研磨，加0.75 ml RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，取蛋白样品至EP管中，加入5×SDS蛋白上样缓冲液，混匀，95 ℃～100 ℃煮5 min。采用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白(40 μg)。将分离的蛋白质印迹转移到PVDF膜上，1×TBST洗膜3次，每次5 min，然后将其浸入5%脱脂奶粉的TBST中常温水平摇床摇晃封闭2 h。1×TBST洗膜3次，每次5 min，用ERK5(1∶1000)、p-ERK5(1∶1000)、MEK5(1∶1000)、MEKK3(1∶1000)和β-actin(1∶1000)一抗孵育，4℃过夜。1×TBST洗膜3次，每次5 min，加入HRP标记的羊抗兔第二抗体(1∶1000)，常温孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次5 min，ECL化学发光法获取胶片，测定灰度值。

1.9 伦理学审查 研究方案经由长春中医药大学动物实验伦理委员会审批，批号：20190035，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 药物活性成分及靶点 对XZHLF各中药进行ADME筛选，以GI absorption=High、Drug likeness>2个yes为限定条件，筛选出110个活性成分，分别从黄芪、穿山甲、鳖甲、钩藤、红景天中筛选45、13、13、41、16个活性成分，其中天冬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、缬氨酸为穿山甲与鳖甲共有活性成分，脯氨酸为鳖甲、穿山甲和黄芪共有活性成分，山奈酚为钩藤、黄芪和红景天共有活性成分，槲皮素为钩藤、黄芪和红景天共有活性成分，香豆素为黄芪和红景天共有活性成分。在Swiss Target Prediction数据库获取923个XZHLF各中药活性成分靶点。

2.2 XZHLF“药物-活性成分”网络构建 将XZHLF各中药、XZHLF各中药活性成分、XZHLF各中药活性成分靶点导入Cytoscape 3.7.1软件，并进行网络拓扑分析，构建“药物-活性成分”网络图。此网络共涉及115个节点，128条边(图1)。

2.3 肝纤维化疾病靶点 将GeneCards、OMIN数据库获得的肝纤维化疾病靶点导入到微生信网站，制作韦恩图，取并集得到6823个肝纤维化疾病靶点(图2)。

2.4 XZHLF防治肝纤维化的潜在作用靶点 将肝纤维化疾病靶点与XZHLF各中药活性成分靶点导入到微生信网站，制作韦恩图，取交集得到647个XZHLF防治肝纤维化的潜在作用靶点(图3)。

2.5 XZHLF防治肝纤维化的“活性成分-潜在作用靶点”网络构建 将XZHLF防治肝纤维化潜在作用靶点与XZHLF各中药活性成分导入Cytoscape 3.7.1软件构建“活性成分-潜在作用靶点”网络图。因网络过于复杂，故通过网络拓扑分析，取Degree值≥15的潜在作用靶点与XZHLF各中药活性成分构建网络。此网络共涉及170个节点，1950条边(图4)。

2.6 XZHLF防治肝纤维化的KEGG通路富集分析和GO生物过程富集分析 KEGG通路富集分析和GO生物过程富集分析中P值代表富集程度由颜色表示，count值代表富集基因数由气泡大小表示，横坐标代表基因比例，纵坐标代表信号通路名称。KEGG通路富集分析发现，XZHLF防治肝纤维化潜在作用靶点与MAPK信号通路关系较为密切(图5)。GO生物过程富集分析发现，XZHLF防治肝纤维化潜在作用靶点与MAPK级联反应的调控关系较为密切(图6)。

注：类三角形代表XZHLF各中药，圆形代表XZHLF各中药活性成分并用不同的颜色标记，其中粉色代表各中药共有的活性成分，圆形面积越大代表XZHLF各中药活性成分连接的XZHLF各中药活性成分靶点越多。

图2 肝纤维化疾病靶点韦恩图

2.7 “成分-靶点-通路”网络 将富集在MAPK信号通路上的靶点、与这些靶点相应的XZHLF活性成分以及与这些XZHLF活性成分相映射的其他通路导入Cytoscape 3.7.1软件构建“成分-靶点-通路”网络关系图，该图共有156个节点，744条边(图7)。

2.8 XZHLF对ERK5通路基因表达的影响 WesternBlot结果显示，M组的大鼠肝组织内ERK5、p-ERK5、MEK5和MEKK3蛋白水平较K、Y、G、Z、D组明显增加，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；K组的大鼠肝组织内ERK5、p-ERK5、MEK5和MEKK3蛋白水平较Y、G、Z、D组明显减少，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(图8)。

图3 XZHLF防治肝纤维化潜在作用靶点韦恩图

注：图中粉色圆形代表XZHLF各中药活性成分，圆形面积越大代表XZHLF各中药活性成连接的XZHLF防治肝纤维化潜在作用靶点越多；蓝色菱形代表XZHLF防治肝纤维化潜在作用靶点，菱形面积越大代表XZHLF防治肝纤维化潜在作用靶点连接的XZHLF各中药活性成分越多。

图5 KEGG通路富集分析

图6 GO分类富集分析气泡图

注：绿色圆形代表XZHLF活性成分，蓝色菱形代表富集在MAPK信号通路上的靶点，橙色类三角形代表信号通路。

3 讨论

中医学的“血瘀”、“癥瘕痞块”与现代医学纤维组织增生性疾病具有密切相关性。肝纤维化可归属为胁痛、黄疸、痞块、癥瘕、积聚等范畴[9]。目前研究[10]认为，肝纤维化是肝硬化的早期可逆阶段，还未形成坚硬不移的肿块，为有形之癥瘕的早期，是探求有效药物治疗肝硬化道路上的一个重要突破点。其中医治疗方法目前可采用解毒化湿、益气养阴，消癥散结、化痰通络等方法[11]。XZHLF由黄芪、穿山甲、鳖甲、钩藤、红景天五味中药组成，具有消癥散结，扶正活络的作用。

通过KEGG分析发现XZHLF可能通过MAPK信号通路防治肝纤维化。真核细胞内已确定有4条MAPK信号通路, 即细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2) 通路、c-Jun氨基末端激酶 (JNK) 通路、p38MAPK通路以及ERK5通路[12]。ERK5以三级激酶级联反应方式进行级联反应，首先刺激因素先激活MEKK2/3，然后由激活的MEKK2/3激活MEK5，最后激活的MEK5再去激活ERK5[13-14]。MEK5是目前发现ERK5唯一的上游激酶。MEK5对ERK5具有高度特异性，即使过表达了也不会激活MAPK家族的其他成员[15]。研究表明，ERK5与细胞的生存、增殖和分化有着密切的联系。ERK5通路对于心血管系统的胚胎发育具有重要作用[16]，在神经系统中也发挥重要作用[17]。有研究[18]表明ERK5信号通路在肾小球系膜细胞的病理生理过程中起重要作用，能够诱导系膜细胞收缩、增殖和细胞外基质积聚。Ramsay等[19]研究表明，ERK5介导的信号对前列腺原位转移癌模型有显著的促进形成作用。Urushihara等[20]研究表明，在慢性肾小球肾炎中，磷酸化的ERK5能够促进细胞活性和ECM的堆积。现有研究表明，MAPK家族的ERK5通路能够通过调节ECM的表达促进纤维化的发展，故本研究通过实验验证XZHLF可能通过ERK5通路来防治肝纤维化。

注：与K组比较，*P<0.05;与M组比较，#P<0.05。

本研究的结果表明，与K组相比较，M组大鼠肝组织内ERK5和p-ERK5蛋白的表达水平明显升高，同时作为ERK5级联反应中的上游蛋白MEK5和MEKK3蛋白的表达水平也随之明显升高，ERK5通路被激活，蛋白表达水平明显增加；G、Z、D组与M组相比较，ERK5通路级联反应中的ERK5、p-ERK5、MEK5和MEKK3蛋白的表达水平均有所降低，ERK5通路受到抑制，其中G组抑制的作用最为明显。XZHLF对肝纤维化大鼠肝组织中的ERK5通路起到明显的抑制作用，降低了ERK5在肝组织中的含量。提示XZHLF抑制肝纤维化可能是通过抑制ERK5通路的激活，减少ECM的表达实现的，但其中的作用机制还不明确，需要更深一步的探索研究。

综上，本研究从网络药理学角度揭示了XZHLF防治肝纤维化可能的分子机制，并实验验证了XZHLF可能是通过抑制ERK5通路的激活，减少ECM的表达实现抑制肝纤维化的。为XZHLF的进一步药效物质基础分析和作用机制考察提供了参考依据，同时也使以后的相关研究更有针对性。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：田乐负责课题设计，资料分析，撰写论文；王颖航参与收集数据，修改论文；潘志负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。