HS-SPME结合GC-MS/GC-O法分析致中和五加皮酒的特征香气成分

麻龙花，陈 峰，孟庆然，高文杰

(1.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418；2.美国克莱姆森大学食品、营养与包装系，南卡罗琳娜州克莱姆森29634；3.上海应用技术大学生态技术与工程学院，上海 201418)

五加皮酒是我国民间广泛配制饮用的传统药酒，其发展至今已有数百年历史。早在我国明朝时期，著名医药学家李时珍所著的《本草纲目》就有五加皮酒的记载，是民间祛风湿、补肝肾、强筋骨的保健名酒。传统五加皮酒一般以白酒或高粱酒为基酒，加入五加皮、人参、肉桂等中药材浸泡而成[1]。其中，以浙江致中和实业有限公司生产的五加皮酒为代表。致中和五加皮酒选用五加皮、当归、党参、地榆、山奈、砂仁、玉竹等二十几种中药材为原料，以特酿白酒为酒基进行浸泡，同时添加蜜酒、白糖、蜂蜜等为辅料进行调味；采用独特的“九坛发酵，四度浸药”酿造工艺酿制而成[2]。五加皮酒入口醇厚甘甜，回味绵长，能吸收最自然的营养成分，具有活血益气[3]、缓解体力疲劳[4]、增强人体的免疫力等功效。

五加皮酒的特殊香味是由作为原料的中药材中的挥发性成分与白酒基酒中的一些挥发性成分共同构成的[5]。相比普通白酒，五加皮酒的制作原料和过程更为复杂，其所含微量成分(挥发性成分)的种类也远多于普通白酒。因此，深入研究五加皮酒中香气成分的种类及含量，不仅能够加深对五加皮酒的认识，同时也为药酒区别于普通白酒提供重要的参考依据[6]。

目前，用于分离提取酒中香气物质的方法主要包括顶空固相微萃取法(Headspace Solid-phase Microextraction，HS-SPME)[7]、液液萃取法(Liquid-Liquid Extraction，LLE)[8]、同时蒸馏萃取法(Simultaneous Distillation and Extraction，SDE)[9]、溶剂辅助风味蒸发法(Solvent Assisted Flavor Evaporation，SAFE)[10]、磁力搅拌棒吸附萃取法(Stir Bar Sorptive Extraction，SBSE)[11]等。其中，HS-SPME 是将待测样品加热后，通过萃取头将样品上部空间的挥发性组分吸附，并通过一段时间后达到分配相平衡[12]。该方法具有萃取时间短、操作简便，萃取成分逼真等优点[13]，一般与气相色谱-质谱联用仪结合使用，在食品的香气分析中使用频繁，应用广泛。此外，许荣年等[14]用气相色谱-质谱联用法测定五加皮酒中桂皮醛、4-甲氧基水杨醛、丁香酚、蒿本内酯、对甲氧基桂皮酸乙酯含量。张雯雯等[15]采用近红外光谱法测定五加皮酒提取液中特征性成分甘草酸、木香烃内酯、去氢木香内酯含量。陈青俊等[16]采用了高效液相色谱法测定五加皮酒中丁香酚、蒿本内酯、对甲氧基桂皮酸乙酯含量。然而，有关五加皮酒风味物质的系统研究却未见报道，对五加皮酒的品质控制和质量改进产生了一定影响。因此，对五加皮酒香气组成的研究具有非常重要的现实意义。

本实验采用HS-SPME 结合GC-MS 联用及GC-O 技术研究致中和五加皮药酒中香气组成；采用谱库检索、双柱保留值分析对比、标准品比对、香气描述及参考文献等数据进行定性分析；应用外标法定量并结合相关阈值计算其中嗅闻强度高、持续时间长的香气组分的OAV 值，并通过GC-O 强度分析和OAV 值共同确定出五加皮酒的主体香气成分，为后续深入研究五加皮酒芳香成分，优化药酒口感，改善药酒品质等提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

五加皮药酒(38%vol)：由浙江致中和实业有限公司提供。

实验所需的标准物质：辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、癸酸乙酯、水杨酸甲酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、左旋乙酸冰片酯、十二酸乙酯、十六酸乙酯、茴香脑、大茴香醛、丁香酚、桂皮醛、樟脑、甲基庚烯酮、糠醛、苯甲醛、苯乙醇、异戊醇、正己醇、丙醇、(-)-4-萜品醇、正戊醇、异丁醇、4-萜烯醇、4-烯丙基苯甲醚、β-紫罗兰酮、2-壬酮、苯甲酸、β-石竹烯，纯度均大于97 %，购于Sigma-Aldrich 公司(上海)。正构烷烃(C5—C30)混合物，购自Sigma-Aldrich公司(上海)。

试剂及耗材：去离子水来自Milli-Q 超纯净化系统(美国Millipore 公司)；无水硫酸钠、氯化钠、无水乙醇等均为国产分析纯试剂。

仪器设备：手动SPME 进样器和50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，美国Supelco 公司；7890A GC-5975C MS 和7890A GC(配有EI 离子源和NIST 2.0 数据处理系统)，美国Agilent 公司；7890A GC-O(配有ODP 3嗅闻检测器)，德国Gerstel公司；极性柱HP-Innowax 柱(60 m × 0.25 mm i.d.×0.25 μm)和非极性柱DB-5 柱(60 m × 0.25 mm i.d.× 0.25 μm)，美国Agilent 公司；电子恒温不锈钢水浴锅，上海康路仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 顶空固相微萃取

参考Liu 等[17]报道的方法，取8.0 mL 五加皮酒样(酒精度稀释至10%)于20 mL干燥洁净的顶空瓶中，准确称量2.0 g 氯化钠加入其中，然后用带有橡胶垫的铝盖密封，放入水浴锅中。将装有50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头插入顶空瓶中，萃取头距液面2～3 mm，50 ℃恒温萃取45 min。萃取完毕，直接将萃取头插入气相色谱进样口，于250 ℃解析5 min后，启动GC-MS检测分析。

1.2.2 气相色谱及质谱条件

色谱柱：HP-Innowax (60 m × 0.25 mm i.d.×0.25 μm)和DB-5 (60 m × 0.25 mm i.d.× 0.25 μm)；载气(He)流速1.2 mL/min，不分流；升温程序：40 ℃平衡2 min，接着以5 ℃/min 升温至120 ℃，最后以3 ℃/min升温至250 ℃并保持20 min。

质谱条件：EI 源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度280 ℃；四级杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z 30～450。

1.2.3 GC-O分析

参考Gao 等[18]报道的方法，筛选4 名嗅觉较灵敏的感官评审人员(2 男2 女)进行GC-O 分析。每个评审人均熟悉待测酒样，而且经过培训，基本能描述所闻的味道及香气强度并记录出现时间。香气强度值用“0～4”分表示，0 表示没有闻到香气，1 表示香气微弱，2 表示香气强度中等，3 表示香气强度较强，4 表示香气强度最强。对每个样品做6次GC-O 试验，每次试验时间为80 min。为防止嗅觉疲劳及保证试验准确性，每名嗅闻人员1 次嗅闻20 min 左右，并在每个阶段0～20 min、20～40 min、40～60 min、60～80 min 至少嗅闻1 次。最后统计同一出峰位置3 次以上(包括3 次)有气味描述及2 次有相同的气味描述的保留时间、持续时间及香气强度值，其香气强度值为该成分6 次嗅闻记录的香气强度的平均值。

1.2.4 定性分析

根据NIST05.L、wiley7n.L、W8N08.L 三大谱库检索进行比对定性，选择匹配度大于80 的化合物进行进一步定性试验。根据改进的Kovats法，在各组分中添加C5—C30正构烷烃混合物，根据烷烃的保留时间来计算化合物的RI 值。同时，分别计算各组分在两种不同极性固定相的毛细管色谱柱上的保留指数(RI)。待GC-MS 分析后，与标准品的RI值和质谱图比对定性，没有标准品的化合物通过计算其RI 值与文献报道的RI 值比对定性。定性结果通过计算双柱保留值、标准品比对、香气描述及参考文献比对最后确认。

1.2.5 定量分析

1.2.5.1 外标标准曲线方法

用标准样品配制不同浓度的标样，在与待测样品完全相同的操作条件下，测得标样中各化合物在不同浓度下的峰面积，绘制标准工作曲线，从而计算待测化合物含量。

1.2.5.2 标准溶液配制

分别取100 μL 已知浓度的标准品溶液，置于10 mL 容量瓶中，用无水乙醇溶液定容，配成标准溶液，然后依次稀释成5 个浓度梯度：250 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、10 mg/L、1 mg/L。在与待测样品完全相同的色谱质谱条件下进入GC-MS进行分析。以物质的浓度为横坐标，物质的峰面积为纵坐标，建立标准曲线，以此计算样品中各组分的含量，实验重复3次。

1.2.6 主体香气成分的确定

香气活力值(odor activity value,OAV)是香气物质的浓度与其阈值的比值，用来评价各香气物质对酒整体香气的贡献。通常认为OAV 大于等于1 的物质对酒的风味有贡献。

计算公式为：OAV=Ci/OTi

式中：Ci为化合物i 在酒中的含量；OTi为化合物i在相关文献中查到的阈值。

2 结果与分析

2.1 五加皮酒中挥发性成分GC-MS分析

应用顶空固相微萃取法对五加皮酒进行预处理，采用GC-MS 技术检测得到的五加皮酒中挥发性物质的离子图见图1，经GC-MS 鉴定的五加皮酒挥发性物质分析结果见表1。

图1 五加皮酒香气成分HS-SPME/GC-MS分析总离子流图

从表1 可以看出，五加皮酒采用GC-MS 方法共鉴定出83 种风味物质成分，其中酯类19 种，醇类7种，醛酮类13种，萜烯类31种，酸类4种，烯烃类3种，其他物质6 种。其中萜烯类物质种类占挥发性物质总数量的37.3%，是五加皮酒中数量最多的一类风味化合物。

表1 五加皮酒香气物质GC-MS分析结果

续表1 五加皮酒香气物质GC-MS分析结果

2.2 五加皮酒中主要香气物质成分定性分析

2.2.1 萜烯类物质分析

萜烯类化合物是测得挥发性化合物中数量最多的一类，占全部检测出挥发性物质总量的37.3%，且这些萜烯类化合物在已发表的有关白酒风味的文献中鲜有报道，推测它们来源于制酒过程中用于浸泡的中药材。萜烯类化合物广泛存在于植物中，是构成某些植物的香精、树脂、色素等的主要成分，也是中草药中广泛存在的一类重要的化合物。这类化合物具有许多的生理活性，如抗癌[19]、抗病毒[20]、抗炎症[21]等。通过实验分析发现，萜烯类化合物对五加皮酒药香风味有着较大的贡献。其中，来源于中药材五加皮的有α-蒎烯、β-石竹烯、桉油烯醇、芳樟醇、右旋香芹酮、4-萜烯醇、α-松油醇、马鞭草烯酮、邻-异丙基甲苯[22-24]；来源于中药材肉桂的有茴香脑、桉叶油素、(-)-去氢白菖烯、香叶基丙酮、4-异丙基甲苯[25]；来源于中药材栀子的有樟脑、(-)-4-萜品醇、橙花醇[26]；来源于中药材砂仁的有莰烯、γ-松油烯、d-柠檬烯[27]；来源于中药材丁香的有α-律草烯[28]；来源于中药材木香的有α-杜松醇[29]；来源于中药材枸杞的有β-紫罗兰酮[30]。大量文献证实萜烯类化合物广泛存在于酒中。胡光源等[31]在董酒中鉴定出(-)-α-雪松烯、δ-杜松萜烯；利勤[32]在米酒中检测到萜品油烯、α-水芹烯；王志娟等[33]在竹叶青酒中发现了来自于药材的d-柠檬烯；马玥等[34]在葡萄酒中检测到了(-)-玫瑰醚；全巧玲[35]在啤酒中鉴定出(R)-(+)-β-香茅醇；范文来等[36]在董酒中检测到了p-茴香醛。此外，酒中的一些萜烯类物质可能来源于在制曲时添加的一些其他中药材。

2.2.2 酯类物质分析

在五加皮酒中，酯类物质是仅次于萜烯类物质的第二大类挥发性物质。酯类物质是酒醅中含量较高的酒精在发酵过程中代谢产生的，是构成五加皮酒果香及花香香气的主要贡献物质[37]。一般认为，酵母氨基酸或糖代谢产生的高级醇和乙酰辅酶A 反应形成了乙酸乙酯；而在酵母脂肪酸代谢过程中产生的脂酰辅酶A 醇解产生了一些脂肪酸乙酯，如丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯等[38]。在检测到的21 种酯中，戊酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯都是应用广泛的食用香料，具有令人愉悦的水果香气和酒香。乙酸异戊酯具有香蕉气味；庚酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯具有菠萝气味；十六酸乙酯有微弱蜡香、果爵和奶油香气；3-苯丙酸乙酯呈甜的水果香和蜂蜜似的花香香气。反式-4-癸烯酸乙酯曾在葡萄酒中[39]检测到过，呈蜡香和梨香。左旋乙酸冰片酯是作为原材料的中药材砂仁中的主要成分[40]；作为药酒中中药原材料中的主要成分还有肉桂中的乙酸异龙脑酯[41]，丁香中的水杨酸甲酯[28]等；这些挥发性成分在五加皮酒中均有检测到。

2.2.3 醇类物质分析

五加皮酒的基酒为白酒，白酒的主要成分乙醇赋予了五加皮酒酒香，其他醇多以呈味为主，呈香为辅。一些酒中比较常见的高级醇，如苯乙醇和异戊醇等，呈果香或者花香，对协调五加皮酒香味也具有一定贡献。正己醇属于C6醇类物质，这类物质通常都具有青草气味，会给五加皮酒的香气产生不好的影响[37]。此外，五加皮酒中还检测出了丙醇、仲丁醇、正戊醇、异丁醇。

2.2.4 酸类物质分析

酸类物质是五加皮酒在发酵过程中，由酵母代谢或者醇类物质氧化产生的。五加皮酒中共检测出了4 种酸类物质，它们分别是辛酸、正癸酸、苯甲酸、十二酸。苯甲酸和十二酸有油脂气味，正癸酸和辛酸有不愉快的气味。一般认为，酸类物质有利于酒体复合香气的产生。

2.2.5 醛酮类物质分析

醛酮类化合物的数量高于酸类和醇类。醇的氧化或者酸的还原会产生醛酮类化合物，是五加皮酒中重要的呈香呈味物质[42]。苯甲醛有浓郁的苦杏仁气味；异戊醛、庚醛、壬醛、2-庚酮都具有水果的香气；正己醛、2-壬酮、仲辛酮、2-正戊基呋喃都具有清新的绿色草木香；2,3-二氢-2,2,6-三甲基苯甲醛、3-丁基-1(3H)-异苯并呋喃酮都具有药草的气味；糠醛有特殊气味。Z-9,17-十八碳二烯醛是一种中药材提取物，无气味。

2.2.6 烯烃类及其他类物质分析

五加皮酒中共检测到3 种烯烃类物质，6 种其他类物质。苯乙烯有特殊气味；2,4-二甲基苯乙烯有类似丁香的气味；3-异丙基-6-亚甲基-1-环己烯有薄荷香气。这类物质不被认为是五加皮酒的呈香物质。其他挥发性物质中，芳香族化合物有3种。其中，丁香酚来源于中药材丁香，异丁香酚来源于中药材当归，它们都具有花香气味。4-烯丙基苯甲醚有似茴香的气味；桂皮醛有强烈的肉桂气味，它来自于中药材肉桂；2,4-二叔丁基苯酚有柠檬香气。正丁亚基邻苯二甲酰胺是一种中药材提取物，有药香。

2.3 定量标准曲线

选择GC-O实验中37种嗅闻强度高、持续时间长的重要组分进行定量分析，这些化合物的名称及对应建立的标准曲线如表2 所示。从表2 可以看出，37 组标准曲线的相关系数R2均大于0.99，相对标准偏差RSD 均小于10 %，故该方法能够满足定量要求。

2.4 定量结果与OAV分析

按照2.3 节中建立的标准曲线计算得到37 种化合物的相对含量，并参考相关文献找到它们的阈值，计算得到各化合物的OAV值，结果见表3。

由表3 可知，五加皮酒中主要的呈香物质(OAV＞1)共有15 种，其中酯类有8 种。酯类物质是五加皮酒香气成分的主体，主要贡献果香、花香。这8 种酯中，含量最高的是己酸乙酯，酒中含5658.9 μg/L，其相对应的OAV 值是102；但OAV 值最大的是辛酸乙酯(含2904.2 μg/L，OAV=226)，这是因为在一定的范围内，短碳链酯的阈值随着碳链增长而降低[43]，因而辛酸乙酯相比于己酸乙酯有更高的OAV 值。辛酸乙酯具有类似白兰地酒的香气，而己酸乙酯一般呈现果香、酒香。因为以上两个化合物，其OAV 值均大于100，也被认为是五加皮酒中特别重要的香气成分。除此之外，具有香蕉气味的乙酸异戊酯和异戊酸乙酯也属于五加皮酒的主要香气成分。丁酸乙酯的含量为439.3 μg/L，己酸乙酯的含量为5658.9 μg/L，它们的含量之比为0.07∶1。有研究者认为，丁酸乙酯与己酸乙酯的比值＜0.1，即说明酒的酒体协调[44]。水杨酸甲酯是中药材丁香中的香气物质，是五加皮酒中药香的主要贡献者。另外，戊酸乙酯(果香)、癸酸乙酯(果香、甜香)的OAV 值大于1，也被认为是五加皮酒中的主要香气物质。虽然丁香酚(花香、辛香)的OAV 值只有18，在所有香气的OAV 值当中居中，但其香气强度值最大(=4)，因此也可以认为是致中和五加皮酒中最重要的香气物质之一，也是五加皮保健酒区别于白酒的特色风味成分。

表2 定量标准曲线

表3 HS-SPME法提取五加皮酒挥发性成分定量结果及OAV值

茴香脑来源于中药材肉桂，具有甜香、带茴香的气味，不仅具有最高的OAV 值(OAV=811)，也是含量最高的物质(=29502.5 μg/L)。从香气强度值来看，茴香脑(=3.7)仅次于丁香酚(=4)，基本可以确定是五加皮酒中的关键香气物质之一。浓度最高的4 种物质中，茴香脑、己酸乙酯被认为是重要香气物质；而乙酸乙酯(=7249.9 μg/L)和异戊醇(=6161.7 μg/L)虽然浓度较高，但它们较低的OVA 值(＜1)，说明二者对酒的整体香气贡献度较低。p-茴香醛具有强烈的茴香香气，其阈值低，因此具有较高的OAV 值(OAV=29)，同时具有较高的香气强度(=2.7)。异丁香酚(具有甜香、辛香和花香)、桂皮醛(强烈的肉桂气味)、4-烯丙基苯甲醚(似茴香气味)、樟脑(樟脑的气味)的OAV 值均大于1，且四者的香气强度值均大于3，因此也被认为是五加皮酒的重要呈香成分。

3 结论

3.1 本实验采用HS-SPME 结合GC-MS 及GC-O技术对致中和五加皮酒中香气成分进行定性定量分析。通过谱库检索、保留指数定性、标准品比对定性、香气描述及参考文献共定性出83 种香气物质，其中酯类19 种，醇类7 种，醛酮类13 种，萜烯类31 种，酸类4 种，烯烃类3 种，其他物质6 种。萜烯类物质种类占其总量的37.3%，是五加皮酒中数量最多的一类挥发性化合物。

3.2 采用外标法，通过建立标准曲线，对经GC-O试验筛选出的37种嗅闻强度高、持续时间长的主要组分进行定量分析。其中含量最高(＞5000 μg/L)的4 种物质分别是茴香脑、乙酸乙酯、异戊醇、己酸乙酯。

3.3 对于已经定量过的37 种香气物质，结合相关文献找到它们的阈值，计算得到各物质的OAV 值，OAV 值大于1 即可认为是五加皮酒中的重要香气物质。本研究通过GC-O 强度分析和香气活力值(OAV)计算进一步筛选得到15 种关键香气物质：茴香脑、辛酸乙酯、己酸乙酯、4-烯丙基苯甲醚、p-茴香醛、异丁香酚、丁香酚、乙酸异戊酯、异戊酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、癸酸乙酯、水杨酸甲酯、樟脑、桂皮醛。