葡萄酒中几种潜在有害性物质研究进展

（1.中国长城葡萄酒有限公司技术中心，河北怀来 075400；2.农业农村部酿酒葡萄加工重点实验室，河北怀来 075400）

葡萄酒作为一种低酒精度的发酵酒，不仅具有愉悦的口感和优雅的香气，还含有多种功能保健成分，在当今社交和家庭消费中占据重要的位置。近年来，随着葡萄酒文化的大力传播，葡萄酒消费进入了多元化时代，据国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）统计，2018 年中国葡萄酒消费17.9 亿升，人均消费1.5 升，成为全球第五大葡萄酒消费国。在葡萄酒消费白热化的同时，也要关注其安全风险。葡萄酒在发酵过程中也会产生一些潜在的有害物质，如果控制不当，会对消费者带来健康风险。本文主要介绍葡萄酒中氨基甲酸乙酯、生物胺、赭曲霉毒素A 3种有害物质的形成机制、危害、限量、检测方法、防控措施和在中国葡萄酒中的分布情况，提升消费者的安全意识，规避风险，促进葡萄酒向安全优质方向发展。

1 氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC），其化学分子式为C3H7NO2，分子量为89.09，化学结构见图1。EC 是烟草叶及香烟的天然成分，也是发酵食品和酒精饮料在发酵和贮存过程中天然的伴随产物[1]。EC 具有致癌性、口服毒性，同时具有多位点致癌性，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病[2]，2007 年被世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer）由2B 类致癌物升级为2A类致癌物，并限制了其使用范围[3]。

图1 氨基甲酸乙酯化学结构

葡萄酒作为一种发酵类的酒精饮料，在发酵过程中会产生EC。2002 年联合国粮食及农业组织确定EC为重点监控物质，并制定了国际标准：规定葡萄酒中其质量浓度不得超过20 μg/L[4]。其他国家也制订了标准限量：加拿大和美国佐餐葡萄酒中EC 的限量不得超过30 μg/L 和15 μg/L[5]。中国目前尚未制订EC 限量标准，2019 年国家市场监管总局已经下发计划并立项，制订《食品安全国家标准酒中氨基甲酸乙酯污染控制规范》，另外有关机构已经对葡萄酒中EC 进行风险监控多年，正在为标准的出台积累数据。

1.1 EC的形成途径

酒精饮料中EC的形成有5 条途径,葡萄酒中主要有3 种途径：氨甲酰化合物（尿素、氨基甲酰磷酸、瓜氨酸等）和乙醇的反应、焦炭酸二乙酯与氨反应、氰化物与乙醇反应。Uthurry 等[6]研究表明，葡萄酒中EC主要由酵母代谢分泌的尿素和乙醇自发作用形成，所以尿素被认为是EC 的主要前体物质。葡萄种植期间施的含氮肥料、葡萄酒发酵过程中添加含氮辅料，以及酵母自身代谢均会形成尿素，有研究证明尿素与乙醇溶液在室温条件下反应72 h 即可生成EC，氨基甲酰磷酸和乙醇溶液在室温条件下反应8 h 即可生成EC[7]。来源于酵母和苹果酸-乳酸发酵的焦炭酸二乙酯与氨反应也可产生EC[8]。对于白兰地等蒸馏酒，氰化物是前体物质，其经过氧化再与乙醇反应生成EC[9]。

尿素与乙醇反应：H2NCONH2+C2H5OH→H2NCO2C2H5+NH3。

焦炭酸二乙酯通过与氨反应：O(CO2C2H5)2+NH3→H2NCO2C2H5+CO2+C2H5OH。

氰化物与乙醇反应：HNC→HOCN；HOCN+C2H5OH→H2NCO2C2H5。

1.2 EC的影响因素及控制措施

影响葡萄酒中EC 含量的因素有前体物质含量、乙醇浓度、pH 值、温度和贮存时间。所以从防控措施上，首先控制前体物质含量，要监控葡萄种植土壤、葡萄树、葡萄汁中含氮情况，限定葡萄含氮量。根据研究，建议发酵前的葡萄汁中可同化氮推荐值为267 mg/L，精氨酸含量不超过1000 mg/L[10]；选择尿素产出低的酵母，合理使用氮类加工助剂；第二，控制EC 形成的反应速率，相关研究表明，温度对EC的形成有重要的促进作用，在贮存期间，葡萄酒中的乙醇还会继续和尿素反应生成EC，要建立合适的货架期。研究表明葡萄酒贮藏温度从20 ℃上升到40 ℃，EC 产生速率上升20～40 倍[10]。对黄酒中EC贮存温度研究发现，EC含量为74 μg/L的黄酒，分别在室温和37 ℃下贮存400 d，EC 分别达到了131.8 μg/L 和509.4 μg/L[11]。在葡萄酒贮存和运输过程中，尽量保持低温避光的环境条件，温度在15～25 ℃，切不可超过35 ℃；pH 值升高，EC含量也会升高，所以要合理控制pH 值[12]；可添加脲酶去除部分EC，但要符合法规要求。

1.3 EC在葡萄酒中分布情况

近年来，随着业内人员对EC的关注，一些国家机构、国家和地方疾控中心以及研究部门开展了对葡萄酒EC的抽检。新疆农业大学和新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心对53 份新疆市售地产葡萄酒中的EC 含量进行检测，EC 含量范围为3.2～291.2 μg/L，平均含量30.0 μg/L，介于0～60 μg/L的样品累积频率达到92.4%[13]，绝大部分高于加拿大和美国的标准，具有较高的污染风险；甘肃省疾病预防控制中心对甘肃省内市售的50 份葡萄酒样品检测中，EC 检出率为98 %，污染水平为1.92～25.81 μg/L，平均值为9.88 μg/L[14]，低于加拿大的限量标准；朱亚楠等人采用SPE 结合GC-MS 法对我国烟台、沙城、昌黎、新疆四大产区的葡萄原酒中EC 含量进行检测，结果显示EC 含量范围是2.12～13.05 μg/L，平均值为5.65 μg/L[15]，表明原酒中EC含量处在较低的水平。

1.4 EC的检测方法

目前检测EC 主要使用气相色谱质谱法（GCMS），灵敏度高、选择性好、稳定性强，根据GB 5009.223—2014 规定[16]，待测样品经过处理加入内标，通过固相萃取、真空浓缩后进行上机检测。周勇等[17]通过对方法细节的优化建立了气质联用测定酒类中EC 的方法，在样品前处理和方法探索上有指导意义。

除此之外常用方法还有高效液相色谱荧光检测器法（HPLC-FLD），但灵敏度不如GC-MS 高，不过操作较前种方法简单。陈达炜等[18]利用HPLCFLD 检测葡萄酒中的EC，平均加标回收率在93.7 %～106.0 %之间，RSD 在1.4 %～2.8 %之间，通过与GC-MS 方法相比较，EC 含量测定结果无明显差异，适合葡萄酒中EC的快速测定。

2 生物胺

生物胺（Biogenic Amines,BAs）是一类低分子量的含氮化合物，存在于动物源食品、发酵类等多种食品中，包括葡萄酒[19-21]。过量的BAs 摄入会对人体产生很大危害，引起头痛、血压升高、呼吸紊乱、心悸、呕吐、皮疹等严重反应，组胺是生物胺中毒性最大的，过量的组胺会导致头痛、消化障碍及血压异常，甚至会引起神经性毒性；酪胺的毒性次之，过量也会引起头痛和高血压等反应[22-25]。在葡萄酒中，乙醇与尸胺、腐胺能抑制组胺脱氢酶、二胺氧化酶和单胺氧化酶的活性，从而增加组胺的含量，同时乙醇会促进组氨酸脱羧基形成组胺。

葡萄酒中常见的生物胺有8 种,如表1 所示，根据其结构分为3 类：脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等)，芳香族(酪胺、苯乙胺等)，杂环族(组胺、色胺等)[26]。许多国家已经规定了葡萄酒中组胺的限量：澳大利亚和瑞士规定葡萄酒中的组胺含量不得高于10 mg/L，法国规定不得高于8 mg/L，荷兰规定不得高于3.5 mg/L，德国规定不得高于2 mg/L[27]。中国目前对葡萄酒中生物胺限量还没有规定，但有关组织和机构已经对市场葡萄酒生物胺的风险持续多年监控中。

表1 葡萄酒中的常见生物胺及分子量、分子式及化学结构

2.1 葡萄酒中BAs的形成

BAs 形成必须具备3 个基本条件：第一是具有可利用的自由氨基酸作为产生生物胺的前体物质；第二是含有能够分泌氨基酸脱羧酶的微生物；第三是处于有利于微生物的生长、氨基酸脱羧酶的合成和提高脱羧酶活性的适宜环境条件[28]。对于葡萄酒中生物胺主要通过两个过程产生：一是乳酸菌主导的苹果酸-乳酸发酵工艺，是BAs 主要的来源途径，二是酵母菌主导的酒精发酵工艺。葡萄原汁还未发酵时存在一些低浓度的胺类物质，在发酵过程中酵母菌能降解部分生物胺，经过苹果酸-乳酸发酵后，乳酸菌会将相应的氨基酸脱羧后形成组胺、酪胺、腐胺、尸胺和苯乙胺等生物胺[29]。

2.2 BAs影响因素及控制措施

葡萄酒中的BAs 含量与葡萄品种、气候条件、葡萄卫生状况、酒种、酿造工艺、贮存条件等诸多因素相关[30]。不同的葡萄原料有不同种类和量的氨基酸和生物胺，Wang等[31]发现有6种生物胺（乙胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺及亚精胺）在葡萄汁中，他们的含量与葡萄品种、成熟度、土壤类型和成分有关；Vasco 等[32]对新酒、陈酿原酒和瓶储原酒3 个阶段BAs检测，发现随着陈酿时间的延长总生物胺呈现降低趋势；苹果酸-乳酸发酵（MLF）工艺是影响BAs 形成的主要因素，乳酸菌的选择，发酵过程pH值的高低，SO2的含量均与BAs 的形成有关，另外白葡萄酒中BAs含量和种类要低于红葡萄酒，主要原因是大部分白葡萄酒不进行MLF 工艺；酒泥陈酿也会增加BAs的风险。

BAs 的防控措施主要从三个方面控制：一是MLF尽量使用商业的乳酸菌，并选择生物胺相关基因缺失的乳酸菌，不要利用野生乳酸菌自然启动发酵；二是减少生物胺前体物质，控制原料中的氮源，避免形成过多的氨基酸；三是控制发酵条件，如pH值、发酵温度、浸渍时间和方式、陈酿以及贮存等。

2.3 BAs在中国葡萄酒中分布情况

BAs 在中国已经被多家检测机构和科研院所调查研究，中国食品发酵工业研究院李志军等[33]抽查了市售的国产250个样品，组胺检出率为52.8%，98.8%的葡萄酒样品中组胺和酪胺含量低10 mg/L，低于澳大利亚的标准，检出率最高的是腐胺为88.4 %，检测值范围为0～46 mg/L，整体良好；Ke等[34]对中国市场销售的456 个葡萄酒样品抽查分析，发现组胺的检出率为59 %，检测值范围为0～22 mg/L，最高值高于澳大利亚、法国等标准，酪胺的检出率为89%，检测值范围为0～21 mg/L，最高是腐胺，检出率98.5%，检测值范围为0～34 mg/L。可见国内市场上销售的葡萄酒仍有少部分的葡萄酒组胺的限量超出国外的标准，需要不断的检测和引导企业制定BAs防控措施，为限量标准的出台奠定基础。

2.4 检测方法

2.4.1 毛细管电泳法

毛细管电泳（Capillary Electrophoresis,CE），是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间电泳速度和分配行为上的差异而实现分离[35]。曹丽伟等[36]利用合成的6-氧-[(1-琥珀酰亚胺)氧酰甲基]-荧光素乙酯(SOFE)作为柱前衍生试剂，毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测生物胺，6 种生物胺在15 min 内完全分离，回收率在93 %～101 %之间，RSD 在0.8 %～4.3 %之间，检出限在2.5×10-11～8×10-11mol/L 之间，该方法灵敏度高，简单便捷。张桂森[37]使用毛细管电泳-连续多光子激发荧光检测组胺、尸胺、腐胺、精胺、亚精胺、苯乙胺6 种常见生物胺，虽然在灵敏度上不如单光子检测，但是分离效率高、检测体积小，适用于复杂体系中生物胺检测。

2.4.2 液相色谱法

相较于上述毛细管电泳法，液相色谱法的前处理过程很复杂，同时也是这种方法的关键步骤，对生物胺的分离提取，目前使用广泛的是成本相对较低、操作没有液液萃取那么繁琐的固相萃取。张文豪等[38]采用邻苯二甲醛/巯基乙胺混合溶液为衍生化试剂，利用反相高效液相色谱法在25 min内测定葡萄酒中组胺、尸胺、腐胺、酪胺、色胺、精胺、亚精胺和β-苯乙胺8 种生物胺，回收率在91.2 %～104.1 %之间，RSD＜5 %，检出限在20～100 μg/L之间，灵敏度高，重现性好，适用于葡萄酒中生物胺的检测。

2.4.3 生物传感器法

生物传感器法是利用酶等物质作为传感器的识别部分，与样品中的生物胺发生一定反应，将其转换成检测器可识别的信号，从而对生物胺进行定性和定量分析。唐晗等[39]利用生物传感器法测定食品中生物胺，芯片设计使用的是成本低且操作简单的以聚甲基丙烯酸甲酯为原料的微流控芯片，结合固定化二胺氧化酶识别元件，通过流动分析法来检测食品中生物胺的总量，此传感器灵敏度高、酶柱储存时间长、回收率高，适用于食品中生物胺快速检测。

3 赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素(Ochratoxins)是异香豆素连接β-苯基丙氨酸上的衍生物，有A、B、C、D 共4 种，其中赭曲霉毒素A（Ochratoxins A,OTA）分布最广，毒性最强，具有很高的化学稳定性和热稳定性,半衰期较长，化学结构见图2。OTA分布于多种食品中，现在被食品添加剂联合专家委员（JECFA）认定的对OTA暴露风险最大的7种食品是谷物、谷物制品、葡萄酒（汁）、咖啡、可可制品、啤酒、猪肉。OTA 可产生致畸、致癌，对人体肾脏、肝脏、神经有毒性，会加速细胞衰老，影响免疫力[40-42]。1993年，OTA被国际癌症研究机构(IARC)归类为2B类致癌物[43]，然而最近由于发现新的毒理基因信息（OTA 的DNA 加合物）在氧化应激中的作用和遗传因子的识别,OTA 被上升为2A 类致癌物[44]。世界葡萄与葡萄酒（OTV）和欧盟建对葡萄酒限量标准定为2 µg/kg[45]。中国食品安全国家标准《食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)中OTA限量标准定为2 μg/kg[46]。

3.1 OTA的形成及影响因素

图2 OTA化学结构

OTA是一种来源于生产原料的生物毒素，其产生主要与作物的生长环境相关，主要与土壤中微生物、环境温湿度、以及作物病虫害感染情况等相关[47]。导致OTA 感染的菌主要是疣孢青霉(Penicillium Vcrrugogum)、赭曲霉（Aspergilhs Ochraceus）、炭黑曲霉（Aspergilhs Carbonarius）3 种微生物，其中炭黑曲霉主要侵染葡萄等水果[48]。当葡萄果实因为物理、化学、致病微生物等原因导致表面破损，炭黑曲霉会侵入果实内部，生长繁殖，产生OTA。

气候变化、葡萄园地理位置和葡萄的健康程度被认为是葡萄中产生OTA 的决定因素[49]，研究发现，环境温度与葡萄和葡萄酒中OTA 的分布呈正相关，环境温度较高的南欧国家的葡萄酒中OTA高于环境温度低的北欧国家[50]，另外来自意大利、西班牙的高温产区葡萄酒样品中OTA 高于2 μg/L的样品达到10 %[51]。葡萄品种和酿造工艺也影响OTA 的产生，红葡萄酒的带皮浸渍会增加OTA 的产生[52]，因此OTA 多见于红葡萄酒，其次是桃红葡萄酒和白葡萄酒。

3.2 OTA的防控措施

对于葡萄和葡萄酒中OTA 的防控措施，首先要选择葡萄园的位置，葡萄园应建立在良好的空气循环空间和避免潮湿地区；其次有条件可以研究培育抵抗力较强的葡萄品种或品系；三是做好葡萄园田间的管理，保持葡萄果穗良好通风、控制病虫害、避免靠近有真菌微生物的土壤；四是葡萄采收中保持葡萄完整健康、做好运输的卫生管理，分选出不健康有病害的葡萄串或葡萄果实，对于病害严重的葡萄酒，缩短浸渍时间，快速压榨，并对葡萄汁过滤澄清。可利用一些物理和化学方法降低葡萄和葡萄酒中OTA，如紫外线照射可以有效抑制炭黑曲霉的生长与产毒；在白葡萄酒中可以使用活性炭吸附来消除OTA。

3.3 OTA在中国葡萄酒中分布情况

中国食品发酵研究院Zhong 等[53]检测了国产183 个红葡萄酒和40 个白葡萄酒中OTA，检测范围分别为0～0.20 μg/kg 和0～0.36 μg/kg，之间，远低于欧盟和中国OTA 的限量标准；全莉等[54]采用酶联免疫法检测分析我国新疆不同产区葡萄酒中OTA含量，结果显示，56.25 %的样品检出OTA，含量均未超过2 μg/kg，同时发现红葡萄酒中的OTA 含量明显高于白葡萄酒，且产区不同葡萄酒中的OTA含量也不同；王兴龙等[55]采用稳定同位素直接稀释/超高效液相色谱-串联质谱法，对国内市售的国产品牌15 种红葡萄酒和5 种白葡萄酒进行检测，所有样本中均未检出OTA，说明中国葡萄酒OTA 含量风险程度较低，安全性良好。

3.4 检测方法

常用检测OTA 的方法有固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC）。宗楠等[56]通过这种方法对国产葡萄酒进行了实验研究，优化了上样体积、淋洗液条件、色谱条件，优化后方法的回收率在94.6%～99.5%之间，RSD 在0.36%～3.01%之间，适合国产葡萄酒中OTA的检测。

4 结束语

本文综述了葡萄酒中氨基甲酸乙酯、生物胺、赭曲霉毒素A 3 种潜在有害物质的危害、形成、常用检测方法、控制措施、在国内葡萄酒中的分布情况。目前葡萄酒生产企业越来越多，葡萄酒品质良莠不齐，上述3 种有害物质的风险也越来越高，应尽快制定相关国家标准，监管部门严格把关，也希望可以提高葡萄酒消费者的安全意识，督促生产企业对于这些有害物质加强控制管理，促进我国葡萄酒发展更加优质安全。