白背叶楤木根皮中总黄酮提取工艺

张新军，张明强，包刘媛，马仲炼

（昭通学院 农学与生命科学学院，云南 昭通 657000）

白背叶楤木（Aralia chinensis L.var.nuda Nakai），为五加科楤木属楤木(Aralia chinensis)的原变种植物，楤木属植物全世界共有40 余种，主要分布在亚洲，少量产于北美洲，我国的楤木属植物资源极其丰富，多达30 余种，主要分布在云南、贵州、四川、辽宁、湖北、河北、广东、安徽、江西等省[1]，其中白背叶楤木在云南昭通的大关、彝良、永善、威信等县有野生，同时也有大量人工种植，在春季3-5月和冬季反季生产中，由顶芽萌发形成的鲜嫩芽苞，即为刺老苞，是珍贵的野生木本蔬菜[2-3]。

近年来，研究人员从楤木属植物中分离出多糖、有机酸、黄酮类、香豆素、木脂素、苯丙烯类、木质素、生物碱、挥发油、芳香化合物等数百种单体化合物，另外还有许多微量元素及其它无机矿物质元素[4-5]。现代研究结果表明：黄酮对人体的生物代谢活动具有密切的关系，具有抗氧化、降低胆固醇、改善血液循环等多种功能[6]。学者已从长白楤木、刺老苞、龙牙楤木等楤木属植物中提取出总黄酮并开展了药理方面的研究[7-12]。然而白背叶楤木相关方面的研究未见报道，故本文以白背叶楤木根皮为材料，测定总黄酮含量及优化提取工艺，旨在为白背叶楤木资源合理开发利用提供理论依据。

1 试验材料与仪器

1.1 材料与试剂

白背叶楤木试验材料于2019年5月，取自于云南省昭通市昭阳区苏家院骡马河水库旁密林中。

芦丁标准品（（中国药品生物制品鉴定所，批号：100080-201811）；无水三氯化铝、95%乙醇、99.97%无水乙醇等，试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）、UV759 紫外可见分光光度仪（上海奥谱勒仪器有限公司）、粉碎机、真空抽滤机（SHZ-D（Ⅲ））、博讯电热鼓风干燥箱、水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、容量瓶、圆底烧瓶、抽滤瓶、冷凝管、移液枪（力辰科技）、移液管、玻璃棒、漏斗等。

2 方法

2.1 样品选择与处理

用自来水将白背叶楤木根洗净，剥下根皮→切成小片段（1-3 cm）→在108℃下杀青1 h →85℃下烘24 h →粉碎机粉碎1-2 min →精确称取原料粉末→倒入圆底烧瓶中→加入对应浓度的乙醇溶液→水浴加热回流浓缩提取→过滤→样品处理溶液（装瓶标记待用）。

2.2 黄酮标准液的制备定

准确称取0.0100 g 芦丁标准品，用体积分数为50%的乙醇超声溶解5 min，并定容至50 mL 的容量瓶中，得到质量浓度为0.2 mg/mL 的芦丁标准品溶液，装入棕色瓶中避光保存备用。

2.3 线性关系考察与黄酮得率计算

2.3.1 芦丁标准曲线的建立

分别移取质量浓度0.2 mg/mL 芦丁标准品溶液0 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、2 mL、2.25 mL、2.5 mL 于25 mL 容量瓶中，各加入l0%的AlCl3溶液1 mL，50%的乙醇溶液定容，摇匀，避光显色30 min 后，于360 nm 波长下测定吸收值，然后以吸光度为纵坐标，芦丁对照品溶液的浓度为横坐标，绘制出标准曲线（如图1）。结果以吸光度A 对浓度C 作最小二乘法回归，标准曲线方程为：Y=0.1207X-0.002，R2=0.9994，线性范围为0.0000～2.5000 mg/L。

图1 芦丁标准曲线

2.3.2 白背叶楤木根皮中的总黄酮得率计算

按上述2.1 的试验方法进行操作，得到样品溶液后，各加入l0%的AlCl3溶液1 mL，分别加0%、30%、50%、70%、95%乙醇溶液定容，摇匀，避光显色30 min 后于紫外分光光度计中测定其吸光度，按下列的公式计得算出楤木根皮中的总黄酮得率：

式中C 为标准曲线方程计算所得的总黄酮质量浓度（mg/L），V 为反应体系总体积（mL），N为稀释倍数，M 为样品质量（mg）。

2.4 稳定性试验

按上述2.1 的试验方法进行操作，提取得样品处理液；精确吸取2 mL 的样品处理液于25 mL 容量瓶中，加入10%AlCl3溶液1 mL，用50%的乙醇定容至刻度线，于室温条件下每隔10 min 测定一次吸光值，分析RSD 值。

2.5 精密度试验

按上述2.1 的试验方法进行操作，提取得到一定浓度的样品溶液6 份，各加入10%AlCl3溶液1 mL，用对应浓度的乙醇定容至刻度线处并充分摇匀，连续测定6 次其吸光度，然后分析数据的RSD 值。

2.6 加样回收率试验

按上述2.1 的试验方法进行操作，得到一定浓度的样品处理液，然后精确吸取已知总黄酮含量的样品溶液6 份，分别加入质量浓度0.2 mg/mL的芦丁标准品和10% 的AlCl3溶液，避光显色30 min 后；按上述操作方法在紫外分光光度计中测定其吸光度，然后依据芦丁标准曲线计算出总黄酮含量，最后根据加样回收公式计算出其回收率。

3 试验结果与分析

3.1 稳定性试验结果

按2.4 试验方法得出，供试品溶液完全显色的最佳时间为30 min，且在4 h 内保持稳定，其RSD等于2.06%，如表1所示，说明此试验方法具有较好的可行性。

表1 稳定性试验数据

3.2 精密度试验结果

通过精密度试验得其RSD 值等于0.21%（n=6），表明该仪器精密度良好，测出的数据可靠性较好，结果见表2。

表2 精密度试验

3.3 加样回收率试验结果

在完成加样回收试验操作步骤后，进行吸光度测定，并依据芦丁标准曲线计算出其总黄酮含量，然后根据回收率公式计算出加样回收率，RSD值为0.14%，由此可知，本方法具有良好的加样回收效果，如表3所示。

表3 加样回收率

3.4 单因素试验结果分析

3.4.1 乙醇体积分数对总黄酮提取效果的影响

当液料比50∶1（mL/g）、提取温度为70℃、提取时间30 min，随乙醇体积分数的逐渐增加，白背叶楤木总黄酮提取率呈先增后减的变化趋势，其中50%乙醇溶液提取率最高，提取率为1.12%，而浓度为95%的乙醇提取效果最差，提取率仅为0.75%。产生这一现象可能是由于楤木根皮中的其他成分比黄酮类化合物更易溶于95%的乙醇溶液中，影响了黄酮类化合物的溶出，结果见表4。

表4 乙醇体积分数对总黄酮提取效果的影响

3.4.2 液料比对总黄酮提取效果的影响

当乙醇体积分数50%、提取温度为70℃、提取时间30 min，由表5 可得：随着液料比的增加，其黄酮提取率呈先增后减的变化趋势；当料液比为1∶90 g/mL 时，其提取率最佳，为1.19%；原因可能是，当楤木根提取液中的料液比为1∶90 g/mL时，总黄酮得率已接近饱和。所以，再增大其料液比，提取率也无明显变化，还可能会导致其它成分的大量溶出，对目标物的溶出造成不利的影响。故以下单因素试验中的料液比均选择1∶90 g/mL。

表5 液料比对总黄酮提取效果的影响

3.4.3 提取温度对总黄酮提取效果的影响

为探究不同温度对白背叶楤木根皮中总黄酮提取率的影响，固定乙醇体积分数为50%，液料比为90∶1（mL/g），提取时间为30 min，设置了5 个不同温度，结果如表6所示。

表6 不同提取温度对总黄酮提取效果的影响

由表6 可知，随着提取温度的不断增加，总黄酮提取率也呈不断递增的趋势，当提取温度为97.8℃时，提取率最大，为1.45%。原因可能是随着温度不断升高，溶液越接近沸点，故使其溶质与溶剂的接触就更充分，溶剂的渗透作用也越强，相关溶质的细胞壁和细胞膜破坏度越强，所以提取效果也就越好。

3.4.4 提取时间对总黄酮提取效果的影响

固定乙醇体积分数为50%，液料比为90∶1（mL/g），提取温度为97.8℃，观察提取时间对总黄酮提取率的影响，结果如表7所示，随着提取时间的延长，总黄酮提取率呈先增后稳的变化趋势。当提取时间为240 min 时，其黄酮的提取率就达到了最大，为1.67%。

表7 不同提取时间对总黄酮提取效果的影响

3.5 提取白背叶楤木根皮中总黄酮的正交试验

由单因素试验所得出的最佳试验条件，进行L9,34正交试验，因素水平表设计如表8所示。

表8 正交试验因素水平表

正交试验（L9,34）结果如表，在影响总黄酮提取率的4 个因素中，温度影响最大，其余三个因素对总黄酮提取率的影响大小依次为：液料比＞乙醇浓度＞提取时间。提取总黄酮的最佳工艺参数组合为A1B3C3D3，即：乙醇浓度40%、液料比1∶100 g/mL、提取温度97.8℃、提取时间3.5 h，在这个最佳试验条件下，测得总黄酮提取率为1.86%。

表9 白背叶楤木根皮中总黄酮提取的正交试验结果表

4 结论

白背叶楤木为五加科楤木属的珍贵木本蔬菜，在昭通分布广泛，其春季嫩茎叶称为刺老苞，为餐桌上的高等鲜蔬，深受老百姓喜爱，同时，白背叶楤木根皮具有较高的药用价值。其同属长白楤木、辽东楤木、云南楤木根茎叶中均含有丰富的黄酮类物质，而作为高原特色药食兼用植物白背叶楤木未见相关报道，本实验以白背叶楤木根皮为材料，分别研究乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素对总黄酮得率的影响，在单因素研究基础上，通过正交实验确定了黄酮的最佳提取条件组合。结果表明各因素对白背叶楤木根皮中总黄酮提取率的影响程度有差异，影响最大的是提取温度，其次是液料比、乙醇体积分数和提取时间，最佳提取条件组合为乙醇体积分数为40%、液料比1∶100 g/mL、提取温度97.8℃、提取时间3.5 h，在这个最佳实验条件下，黄酮提取率最高为1.86%。