野生昭通猕猴桃中维生素C的提取及含量测定

程立君，王世敏，田 虹，贾臣梦，刘健君

（昭通学院 农学与生命科学学院，云南 昭通 657000）

昭通猕猴桃（Actinidia rubus Levl.）属猕猴桃科（Antinidiacese）猕猴桃属（Actinidia），一种浆果类藤本植物，又名藤梨、奇异果等，《本草纲目》中记载：“其形如梨，其色如桃，而猕猴喜食，故有诸名”[1]。猕猴桃的口感好，营养价值高，深受人们的欢迎，其中维生素C（VC）的含量普遍高于一般的水果，享有 “世界珍果”之称。VC 又名抗坏血酸，一种含6 个碳原子的酸性多羟基化合物，是无色无味的片状晶体，易溶于水[2]。它是人体所需要的不可或缺的一部分，是维持人体机能的一种重要的维生素[3]，缺乏VC 会导致多种病症的发生，严重时将导致坏血病、心脏及脾脏损伤等疾病[4]。

昭通市气候适宜猕猴桃的生长，野生猕猴桃资源丰富，其中昭通猕猴桃分布较广，果实酸甜可口，果肉营养丰富[2]，开发利用前景较好，但目前开发利用程度较低。本研究对野生昭通猕猴桃中VC 超声提取的方法进行了优化，并对其含量进行了测定，以期为将来的研究开发提供参考。

1 实验材料

1.1 材料

野生猕猴桃2019年10月采集于昭通市昭阳区盘河乡。

1.2 试剂

钼酸铵、草酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、抗坏血酸、偏磷酸、醋酸、苯酚、无水乙醇、浓硫酸、95%乙醇、葡萄糖等均为分析纯。

1.3 仪器与设备

AX224ZH/E型电子天平（奥豪仪器有限公司）、紫外可见分光光度计 UV-2450（日本岛津有限公司）、UV759 型紫外可见分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司）、Km-1030C 型超声波清洗机（广州科洁盟实验仪器有限公司）、HL/T20MM 型立式高速冷冻离心机（湖南赫西仪器有限公司）、BCD-470WDPG 型冰箱（青岛海尔股份有限公司）、RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、HH.S21-8 数显恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、202-0 型台式干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司），LGJ-10D 型真空冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）。

2 实验方法

2.1 样品的提取流程

VC 的提取工艺流程如下：昭通猕猴桃→去皮→研磨→超声提取→过滤→得待测液。

称取3.0000 g 去皮猕猴桃置于研钵中，加入10 mL 草酸（0.05 mol/L）-EDTA（0.15 mol/L）溶液和10 mL 水充分研磨后，超声提取后定容至250 mL，摇匀后过滤，加入少许活性炭吸附色素后再次过滤，即得提取液。

2.2 VC 含量的测定

VC 含量测定采用钼蓝比色法，参照柳青等人[5]的方法进行。以VC 质量浓度为横坐标（X）、吸光值为纵坐标（Y）建立多糖标准曲线。标准曲线（见图1）的线性回归方程为y = 0.016x - 0.002，R²=0.9990，VC 对照品质量浓度的线性范围为0 ～14 μg/mL，依据标准方程计算样品中VC 浓度，依据公式（1）计算样品中还原型VC 含量。

图1 705 nm 下VC 标准曲线

式中：W—还原型VC 含量（mg/100 g）；C—待测液中还原型VC 的质量浓度，mg/mL；V1：提取液总体积（mL）；V2：测定时样品体积（mL）；M—猕猴桃样品重量，g。

2.3 单因素实验

2.3.1 料液比对VC 提取量的影响

分别设置料液比（m:v）为1∶6、1∶12、1∶18、1∶24、1∶30、1∶36 g/mL 六个梯度，按2.1 的方法，在30℃下超声提取30 min 后过滤，滤液按2.2 方法测定VC 含量，每组设3 次重复。

2.3.2 提取时间对VC 提取量的影响

在筛选得到的最佳料液比基础上，分别设置提取时间5、10、15、20、25、30 min 六个梯度，按2.1 的方法，在30℃下超声提取后过滤，滤液按2.2 方法测定VC 含量，每组设3 次重复。

2.3.3 提取温度对VC 提取量的影响

在筛选得到的最佳料液比和提取时间基础上，分别设置提取温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃六个梯度，按2.1 的方法，超声提取后过滤，滤液按2.2 方法测定VC 含量，每组设3 次重复。

2.4 响应面法优化实验

在单因素实验的基础上，利用Design Expert软件进行Box-Behnken 响应面实验设计（见表1），以料液比A、提取时间B、提取温度C 为自变量，以野生昭通猕猴桃中VC 含量为响应值（Y），进一步优化昭通猕猴桃VC 的提取，每组设3 次重复。

表1 响应面设计的因素与水平表

3.结果与分析

3.1 单因素实验结果分析

3.1.1 不同料液比对VC 提取量的影响

不同料液比对野生昭通猕猴桃VC 提取量的影响见图2。由图2 可知，不同料液比条件下，昭通猕猴桃中VC 的提取量之间存在显著差异（F=121.5429，P＜0.01）。随着料液比的升高提取量随之增加，当料液比为1∶24 时，VC 提取量达到最高（121.66 mg/100 g），之后料液比继续升高，VC提取量略有下降，表明提取的最佳料液比1∶24。

图2 料液比对VC 提取量的影响

3.1.2 不同提取时间对VC 提取量的影响

不同提取时间对野生昭通猕猴桃VC 提取量的影响见图3。由图3 可知，提取时间对昭通猕猴桃中VC 的提取量有显著影响，方差分析结果显示F=148.6085，P＜0.01。随着提取时间的延长VC 提取量逐渐上升，超声提取25 min 时，VC 提取量达到最高（125.06 mg/100 g），之后维持稳定。

图3 提取时间对VC 提取量的影响

3..1.3 不同提取温度对VC 提取量的影响

不同提取温度对野生昭通猕猴桃VC 提取量的影响见图4。由图4 可知，不同提取温度条件下，昭通猕猴桃中VC 的提取量之间存在显著差异（F=580.9722，P＜0.01）。VC 提取量随着提取温度的上升出现先增加后下降的趋势，当提取温度20℃时提取量最低，为114.42 mg/100 g；提取温度在30℃时，VC 提取量达到最高（130.13 mg/100 g），可能是因为超声提取时低温下VC 浸出率较低，但温度过高VC 又容易出现氧化。

图4 提取温度对VC 提取量的影响

3.2 响应面实验结果分析

3.2.1 响应面实验结果

基于单因素筛选实验的结果，以料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）3 个因素为响应面变量，以昭通猕猴桃中VC 提取量为响应值，利用Box-Behnken 软件进行响应面实验设计及实验结果见表2。

表2 响应面设计及实验结果

3.2.2 回归模型的建立及方差分析

对表2 中响应面实验数据进行回归拟合，得到野生昭通猕猴桃中VC 提取量与料液比、提取时间、提取温度之间的多元回归方程为：Y=139.82-0.77A-8.85B+0.99C-2.78AB-2.01AC-7.96BC-21.37A2-11.40B2-14.88C2。该模型的方差分析结果见表3。

表3 响应面二次模型方差分析结果

由表3 可知， 该模型的F 值为11.38，P=0.0021（P＜0.01），表明回归方程模型是可靠的；决定系数R2为0.9360，表明模型可以解释93.60%的总体变异情况，回归模型相关性较高。根据回归方程的方差分析结果可知，该模型一次项B 变量的P=0.0077＜0.01，A 变量和C 变量的P 值分别为0.7588 和0.6931，均大于0.05，表明超声提取时间对昭通猕猴桃中VC 提取量有极显著影响，而料液比和提取温度对昭通猕猴桃中VC 提取量的影响不显著，各因素对VC 提取量的影响顺序为提取时间＞提取温度＞料液比。交互项AB、AC 的P值分别为0.4391 和0.5722，均大于0.05，表明对昭通猕猴桃中VC 提取量的影响不显著；BC 项的P 值为0.0431，小于0.05，表明对昭通猕猴桃中VC 提取量的影响显著。二次项A2、B2、C2的P 值分别为0.0003、0.0107、0.0028，表明三者对昭通猕猴桃中VC 提取量均具有显著影响。

3.2.3 交互作用分析

两因素之间交互作用对昭通猕猴桃中VC 提取量的影响见图5。曲面中相同VC 含量所对应的各因素值在底面上形成曲线，即为等高线图。等高线的形状可以清晰地反映出两因素交互作用对昭通猕猴桃中VC 提取量影响的强弱。等高线越接近圆形，说明交互作用对昭通猕猴桃中VC 提取量的影响越弱；等高线越是接近椭圆形，说明交互作用对昭通猕猴桃中VC 提取量的影响越强；在等高线的中心处附近有极值条件的存在。从图5（a）可以看出，当料液比值保持不变时，昭通猕猴桃中VC 的提取量随着提取时间的上升而增大，曲面的斜率较大；当提取时间稳居不变时，随着液料比值的增大，VC 的提取量曲面斜率较小，说明提取时间对昭通猕猴桃中维生素C 提取量的影响较为显著。从图5（b）可以看出液料比值与提取温度交互作用形成的曲面较平缓，说明其交互作用对昭通猕猴桃中VC 提取量的影响不显著。由图5（c）可以看出提取时间和提取温度的交互作用形成的曲面较陡峭，说明其交互作用对昭通猕猴桃中VC 提取量的影响显著。

图5 各因素交互作用对昭通猕猴桃中VC 提取量的影响

3.2.4 验证实验

根据Design Expert 软件分析，在料液比为1∶24、提取时间22 min、提取温度29℃的条件下，野生昭通猕猴桃中VC 提取量的预测值为141.65 mg/100 g。实际操作条件下，测得野生昭通猕猴桃中VC 的含量为139.85 mg/100 g，与理论值相差1.8 mg/100 g，实验值与理论预测值相差不大，证实了该模型在实际预测上的可用性，说明野生昭通猕猴桃中VC 提取工艺条件就可以用响应曲面法进行优化。

4.结论与讨论

本实验通过在单因素实验的基础上，应用Box-Behnken 响应面实验设计对昭通猕猴桃的超声提取工艺进行优化来提高维生素C的提取量。单因素实验结果表明：料液比为1∶24 时，VC 提取量达到最高（121.66 mg/100 g）；超声提取25 min 时，VC 提取量达到最高（125.06 mg/100 g）；当提取温度在30 ℃时，VC 提取量达到最高（130.13 mg/100 g）。在此基础上进行响应面优化后的最佳工艺条件为：料液比为1∶24，提取时间为22 min，提取温度为29℃，在此工艺条件下，维生素C 提取量达139.85 mg/100 g。张维等人对分布在湖南地区的26 个红心猕猴桃品种中维生素C 测定结果显示其平均含量为106.04 mg/100 g。[6]李跃红等人对11 个不同产地的红心猕猴桃中维生素 C 测定结果其显示平均含量118.18 mg/100 g。[7]本实验采用的野生昭通猕猴桃中VC 含量高于两者研究报道中的平均值，表明昭通猕猴桃具有较好的开发价值，本研究为野生昭通猕猴桃的开发利用提供了基础数据。