昭通市四县区白魔芋和花魔芋中蛋白质含量的测定研究

2021-03-14何宣婷张文艳

昭通学院学报 2021年5期

叶坪，何宣婷,何嵋，彭潇，张文艳，师睿

（昭通学院化学化工学院，云南昭通 657000）

1 引言

魔芋属于被子植物门、单子叶植物纲、天南星科、魔芋属，是一种经济价值和保健价值都非常高的多年生草本植物，又名蛇六谷、雷星、鬼芋、蛇头草、蛇包谷[1]等。我国是魔芋种植大国，种植总面积多达十万多公顷，魔芋资源主要分布在云南、贵州、四川、陕南和湖北等地的山区。魔芋产业是这些地区的重要支柱产业[2]。在昭通市11 县区大面种植的主要有白魔芋（Albus）和花魔芋（Akoac）两种。魔芋产业有巨大的发展前景，在药理价值方面，魔芋是我国的一种古典医药[3]，除具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、减肥作用外，还具有胃肠道保护功能、通便、止血等作用[4]。在食用价值方面，可以制作成魔芋豆腐、魔芋饼干、魔芋粉条、魔芋糕等味道鲜美，口感宜人的食品，也可作为添加剂应用于各类保健食品、美容食品和儿童营养食品之中[5]。在生态价值方面，魔芋的规模化种植，能提高植被覆盖度、减少水土流失、保护生态环境[6]。

魔芋块茎中主要含葡甘聚糖（简称KGM）、蛋白质及多种氨基酸、淀粉、生物碱、神经酰胺、微量元素、维生素等成分[7]。蛋白质是生命的物质基础，是人体中不可缺少的组成成分[8]。蛋白质与人体的营养代谢、氧气运输、信息交流、细胞结构、增强免疫和遗传物质等相关[9]，具有构成机体、修复组织、构成酶和激素等活性物质、供给机体能量等生理功能，也是人体中氮的唯一来源，具有糖类和脂肪不可替代的作用[10]。

考马斯亮蓝法是目前实验室中最常见、灵敏度最高的一种测定蛋白质含量的方法[11]。考马斯亮蓝法测定蛋白质具有成本低、快速简捷、精密度高、显色灵敏、重现性好及干扰物质少[12]等优点，可检测的蛋白质数量低达1 ug[13]，是目前灵敏度最高的蛋白质测定法，可作为微量蛋白质测定的首选方法[14]。蛋白质是一项质量和资源评价的重要指标，用一种快速、准确、方便的方法来检测蛋白质含量是必不可少的[15]。魔芋化学成分种类很多且含量丰富，但目前研究最多的是葡甘聚糖，对其他成分研究应用较少且造成资源浪费，现对昭通市彝良、镇雄、巧家、永善四县区花魔芋和白魔芋中水溶性蛋白质进行提取及含量的测定，旨在为今后昭通地区的魔芋开发利用提供部分理论数据支持和参考依据[16]。

2 实验部分

2.1 实验材料

将采自彝良、镇雄、巧家、永善四县的新鲜白魔芋和花魔芋洗净切成小片，放入40 ℃恒温干燥箱烘20 小时，用粉碎机粉碎过60 目筛后，制得魔芋粉，装入样品瓶中备用。

2.2 实验仪器

2.3 实验药品

表2 实验药品

2.4 实验方法

2.4.1 溶液的配制

蛋白质标准溶液：称取牛血清白蛋白10.10 mg于100 mL 烧杯中，加入蒸馏水溶解，移入100 mL容量瓶，加蒸馏水定容[17]。得0.1010 mg/mL 蛋白质标准溶液，放入4 ℃冰箱中保存。

考马斯亮蓝G-250 溶液：称取100.5 mg 考马斯亮蓝G-250 于500 mL 烧杯中，依次加入95%乙醇50 mL，85%磷酸100 mL，溶解后移入1 L 容量瓶中，最后用蒸馏水定容[18]，得0.1005 mg/mL 考马斯亮蓝G-250 溶液（棕红色），过滤后置于棕色试剂瓶中保存备用。

2.4.2 最大吸收波长的确定

用吸量管吸取蛋白质标准溶液0.5 mL 于10 mL容量瓶中，然后加入考马斯亮蓝G-250 溶液5 mL，最后加蒸馏水定容，摇匀后用分光光度计在波长540～640 nm 下测其最大吸收波长，每隔20 nm 测定一次，结果见图1。

图1 最大吸收波长结果

图1 表明在波长580～600 nm 有最大吸收波长，然后在580～600 nm 之间每隔2 nm 测定一次，结果见图2。

图2 最大吸收波长结果

图2 表明，在波长588 nm 时，测定的吸光度值最大，达到0.499，因此选择588 nm 为最大吸收波长。

2.4.3 标准曲线的制作

以蛋白质标准溶液制作标准曲线，用7 个10 mL的容量瓶做好标记，分别加入标准溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 溶液，加蒸馏水定容，摇匀静置10 min。用722 型分光光度计在波长588 nm 下以0 mL 的标准液容量瓶为空白对照比色，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见图3。

图3 标准曲线制作结果

图3 标准曲线的方程为：Y=0.0557X+0.0829，牛血清蛋白含量（X）和吸光度（Y）的相关系数R2=0.9995，表明方程的线性良好可应用。

2.4.4 蛋白质含量测定方法

将提取液用4000 r/min 的离心沉淀器离心15 min，用吸量管吸取0.2 mL 提取液于10 mL 容量瓶中，加入考马斯亮蓝G-250 溶液5 mL，加蒸馏水定容，室温条件下反应10 min，在588 nm 处测定吸光度，平行做3 个重复，取其吸光度的平均值代入标准曲线方程，求出提取液浓度，代入下列公式计算魔芋中蛋白质的含量。

2.4.5 单因素试验

以提取温度、提取时间和提取料液比三个因素作为对象来进行实验，以确定魔芋中水溶性蛋白质的最佳提取条件。依据查阅的参考文献，综合考虑基础条件设定为：提取料液：1∶35（g/mL）、提取时间50 min，提取温度40 ℃。

2.4.5.1 最佳提取温度的确定

用电子分析天平分别称取8 份永善县白魔芋粉1 g 置于烧杯中，按1∶35（g/mL）料液比加入蒸馏水，搅拌均匀后放入恒温水浴锅中，温度分别为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃，浸提50 min，按上述1.4.4 测定方法进行测定。

2.4.5.2 最佳提取时间的确定

用电子分析天平分别称取8 份永善白魔芋粉各1 g，置于烧杯中，按1∶35（g/mL）料液比加入蒸馏水，搅拌均匀后放入40 ℃恒温水浴锅中分别浸提20、30、40、50、60、70、80、90 min，按上述1.4.4 测定方法进行测定。

2.4.5.3 最佳提取料液比的确定

用电子分析天平分别称取6 份永善白魔芋粉各1 g，置于烧杯中，分别按料液比（g/mL）为1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、加入蒸馏水，搅拌均匀后放入35 ℃恒温水浴锅中分别浸提60 min，按上述1.4.4 测定方法进行测定。

2.4.6 样品蛋白质含量的测定

用电子分析天平分别称取彝良、镇雄、巧家、永善四县的白魔芋粉和花魔芋粉各1 g 于烧杯中，按上述最佳提取条件浸提，得到蛋白质提取液，按上述1.4.4 测定方法进行测定。

3 实验结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 最佳提取温度单因素实验结果

按2.4.5.1 实验方法进行实验，测定吸光度，计算出蛋白质含量，结果见图4。

图4 最佳提取温度单因素实验结果

由图4 可知，蛋白质含量随着提取温度的升高，呈先增加后降低的趋势，温度在25 ℃～35 ℃之间，测得的蛋白质含量随温度升高而增加，是因为分子的扩散速率随温度的升高而增加，有利于蛋白质分子的溶解[19]。当温度为35 ℃时，测得的蛋白质含量最高，达到2.00%，而后随着温度的升高，测得的蛋白质含量开始降低，这是由于温度逐渐升高，蛋白质的结构开始发生变化，水溶性蛋白质含量逐渐降低。因此，提取温度选择35 ℃为宜。

3.1.2 最佳提取时间单因素实验结果

按2.4.5.2 实验方法进行实验，测定吸光度，计算出蛋白质含量，结果见图5。

图5 最佳提取时间单因素实验结果

由图5 可知，在20～40 min 之间，测得的蛋白质含量随提取时间的增加而呈现缓慢上升的趋势。在40～60 min 之间，随提取时间的增加而呈快速上升的趋势。当提取时间为60 min 时，测得的蛋白质含量达到最大值，达到1.98%。60 min 后随着时间的延长测得的含量逐渐降低。为了缩短工时减少能耗，提取时间选择60 min 为宜。

3.1.3 最佳提取料液比单因素实验结果

按2.4.5.3 实验方法进行实验，测定吸光度，计算出蛋白质含量，结果见图6。

图6 最佳提取料液比单因素实验结果

图6可知，提取料液比在1∶25～1∶35（g/mL）之间，随着提取液增加，测得水溶性蛋白质的含量呈现快速上升的趋势。当提取料液比达到1∶35（g/mL）时，测得蛋白质的含量最高，达到1.91%。提取料液比在1∶35～1∶50（g/mL）之间，测得蛋白质的含量开始降低，但变化趋势较为缓慢，这是由于一定体积的提取液已将有效成分基本溶出[20]，提取料液比选择1∶35（g/mL）为宜。

3.2 样品的测定结果

按2.4.4 实验方法进行4 县区花魔芋和白魔芋的蛋白质含量的测定，各县的花魔芋和白魔芋均平行做3 个重复，计算其平均含量，结果见图7。

图7 魔芋水溶性蛋白质含量测定结果

由图7 可知，在不同地区同一品种魔芋中所含的水溶性蛋白质含量有差异，同一地区花魔芋和白魔芋中的水溶性蛋白质含量也有差异，但差异不大。

测得四个县区白魔芋中水溶性蛋白含量最高的县是永善县，达到2.14%。含量的高低顺序是：永善县（2.14%）＞巧家县（2.07%）＞彝良县（1.89%）＞镇雄县（1.87%）

四个县区花魔芋中水溶性蛋白含量最高的县是镇雄县，达到2.12%。含量的高低顺序是：镇雄县（2.12%）＞彝良县（1.98%）＞巧家县（1.93%）＞永善县（1.83%）。

3.3 测定方法的检验

3.3.1 精密性实验

用吸量管分别吸取6 份蛋白质标准溶液各0.2 mL于10 mL 容量瓶中，然后按上述2.4.4 测定方法进行测定，计算RSD 值，如表3所示，得RSD =1.54%＜5%，表明实验仪器精密度较好。

表3 精密度实验结果

3.3.2 稳定性实验

称取永善县白魔芋粉1 g，按上述最佳提取条件浸提得到蛋白质提取液，然后按上述2.4.4 测定方法进行测定，每隔10 min 进行1 次测定，连续测定6 次，记录其吸光值变化，观测其稳定性。如表4所示可知，在显色1 小时内吸光度值比较稳定，RSD=0.11%＜5%，表明1 小时内样品溶液稳定性较好[21]。

表4 稳定性实验结果

3.3.3 重复性实验

分别称取6 份永善县白魔芋粉各1 g，按上述最佳提取条件浸提得到蛋白质提取液，然后按上述2.4.4 测定方法分别进行测定，记录其吸光度值，计算RSD 值。如表5所示，得RSD=1.64%＜5%，表明该方法重复性较好。

表5 重复性实验结果

3.3.4 回收率试验

取6 份已知含量的白魔芋粉各1 g，按照上述最佳提取条件浸提，得到蛋白质提取液。用吸量管吸取0.1 mL 提取液于10 mL 容量瓶中，加入蛋白质标准溶液0.1 mL，然后按上述2.4.4 测定方法分别进行测定，计算回收率及RSD 值，如表6所示，得RSD=2.25%＜5%，表明该方法准确度较高[22]。