枸杞枝叶中乳酸菌的分离及其在徒长枝青贮中的应用评价

陈开琼, 杨其芳, 苟琪, 吕燕, 刘建利

(北方民族大学生物科学与工程学院， 宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室， 银川 750021)

宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)的药用植物，根、叶、果都是宝[1-2]。枸杞徒长枝(俗称“油条”)是在枸杞生长过程中产生的，一般是在良好的水肥条件下，由根、枝干上不定芽萌发后长成的一种生长过旺、发育不充实的枝条。由于徒长枝生长与果实主干枝竞争养分，在枸杞种植过程中被人工修剪后直接扔掉，全国枸杞产区每年总计产生约22万t枸杞徒长枝[3-5]。研究表明，枸杞徒长枝中与枸杞子类似的营养成分和药用成分，可提高动物免疫力，将其开发为饲料可以变废为宝[6-11]。

青贮饲料是利用乳酸菌在密闭缺氧的条件下发酵得到的一种粗饲料，尽可能地保留了底物中的营养物质，降低了粗纤维含量，并且柔软多汁、酸香醇厚、适口性好、采食率高，同时避免了饲草季节性过剩[12]。乳酸菌是青贮过程的关键微生物，多由青贮底物上直接分离而来[13-15]。本课题组前期研究发现，枸杞鲜嫩枝叶在不添加任何外源青贮菌剂情况下自然青贮，品质也不亚于添加商品青贮菌剂青贮的实验组，推测其上附着大量适合青贮的天然乳酸菌。因此，本研究拟从新鲜枸杞枝叶上分离筛选生长快、产酸能力强、青贮品质好的乳酸菌，旨在为后续开发枸杞青贮专用菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1青贮材料 枸杞品种为“宁杞一号”，枝叶于2018年9月采自银川市西夏区地矿局农场枸杞种植地。

1.1.2试验试剂 亚芯秸秆青贮剂(台湾亚芯生物科技有限公司)，糖蜜(广西博华食品有限公司)，细菌基因组DNA提取试剂盒(DP2002，北京百泰克生物技术公司)，2×TaqPlus MasterMix (Dye)(康为世纪生物科技有限公司)，蜜二糖、苦杏仁苷、纤维二糖、核糖、木糖和乳酸锂(上海源叶生物科技有限公司)，对羟基联苯(上海麦克林生化科技有限公司)，其他常规生化试剂购自天津市大茂化学试剂厂。

1.1.3主要仪器 UV-1000紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)、S1000快速梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)、CelDoc XR+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司) 、PHS-3C pH计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.1.4培养基 MRS培养基(1 L)：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、柠檬酸二铵2 g、牛肉浸粉10 g、无水乙酸钠5 g、葡萄糖20 g、吐温-80 1 mL、硫酸镁0.58 g、磷酸氢二钾2.6 g、硫酸锰0.19 g，碳酸钙10 g，琼脂 20 g，调节pH 为6.2～6.4之间。灭菌后摇匀倒平板即为MRS固体培养基。

PY培养基(100 mL)：蛋白胨0.5 g、胰酶解酪朊(Trypticase)0.5 g、酵母提取物1.0 g、吐温-80 0.02%、盐溶液4 mL。再加1.0 g葡萄糖为PYG培养基。

盐溶液(1 L)：无水CaCl20.2 g、MgSO4·7H2O 0.48 g、K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、NaHCO310.0 g、NaCl22.0 g。

BTB-MR试剂(500 mL)：溴百里酚蓝(BTB)0.2 g、甲基红(MR)0.1 g，95%乙醇300 mL，蒸馏水200 mL。

1.2 试验方法

1.2.1乳酸菌的分离纯化 参考孙敏等[16]方法从新鲜枸杞徒长枝上择取完整且无病虫害症状的叶片10 g，加90 mL无菌水， 120 r·min-1振荡2 h，将洗涤液以10倍稀释形成5个梯度稀释液，从中取100 μL涂布于MRS固体培养基平板上，每个梯度稀释液涂布3个平板，放入已被蜡烛耗尽O2的玻璃干燥器内，37 ℃微厌氧培养24 h。MRS固体培养基中添加1% CaCO3，据菌落的大小、颜色、形状、水解圈的有无等挑取菌落，在MRS平板上重复划线3次，得纯化的菌株，以1%的量接种于MRS液体培养基，连续传代2次后，加入25%甘油中，冻存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2优良乳酸菌株筛选 将活化后的菌株以1% 的量接种于MRS液体培养基中，37 ℃、120 r·min-1下培养24 h，每隔4 h测600 nm波长的OD值，同时测pH，绘制生长曲线和产酸速率曲线，比较后筛选出生长最快、产酸能力较强的优良乳酸菌。

1.2.3乳酸菌菌株生化鉴定 参考《乳酸菌分类鉴定及实验方法》[17]测定菌悬液中乳酸菌的系列生化指标，包括H2O2酶的性质、消耗葡萄糖、葡萄糖酸钠是否可以产酸产气、能否直接发酵不同碳水化合物、发酵后产物能否造成明胶的液化以及了解H2S气体是否产生，通过乳酸菌的生化特征辅助鉴定乳酸菌的种类。

1.2.4青贮实验 将青绿少刺的的枸杞徒长枝铡成1～2 cm的小段，混匀后分为若干份，每份500 g，按5%加入糖蜜，以加入0.01 g亚芯秸秆青贮剂作为对照，使用血细胞计数板计算与对照菌剂用量中细胞总数相当试验菌株的用量，喷洒混匀，真空封口，室温放置发酵。每个处理3个重复，青贮45 d后取样分析。

1.2.5青贮后枸杞徒长枝感官评价 青贮结束后，打开乙烯塑料袋尽快进行感官评价，避免饲料因长时间触氧而褐变氧化。参照中国青贮饲料品质评价及德国农业协会(DLG)评分法[18-19]评价饲料的pH、水分、气味、色泽和质地的表现。

1.2.6枸杞徒长枝青贮饲料营养成分和活性成分含量分析 参考《青贮饲料质量检测实用手册》[20]和郭旭生等[21]方法分析9个常规营养成分：粗灰分、粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、乳酸、氨态氮、水溶性碳水化合物、pH、干物质，参考牛艳[22]和闫秀梅等[23]方法测定3个药用成分：枸杞多糖、甜菜碱、黄酮。

表1 枸杞徒长枝青贮饲料感官评价标准Table 1 Score standard of valuation of sensory quality of Goji epicormic silage

1.2.7优良菌株分子测定 参考孙敏等[16]方法提取菌株GJ8的基因组DNA。选通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和R1492(TACC-TTGTTACGACTT)扩增16S rDNA。反应体系(50 μL)：2×TaqPlus MasterMix (Dye)10 μL、模板1 μL、引物各1 μL、ddH2O 37 μL。反应程序:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s；56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min,循环30次；72 ℃延伸10 min。反应产物经1%琼脂糖凝胶检验合格后，扩增产物与引物样品送到昆泰锐(武汉)生物技术有限责任公司测序。经BLAST比对，ML法构建系统发育树。

1.3 数据处理

用Microsoft Excel 2010处理数据，SPSS 20.1统计软件进行统计分析，Origin 8.0绘图。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离筛选

2.1.1枸杞徒长枝叶上分离的乳酸菌 据MRS固体培养基上菌落初步形态，挑取出乳白色圆饼状、边缘整齐、水解圈大而明显的菌株，划线纯化后共获得15株乳酸菌：GJ1、GJ2、GJ3、GJ4、GJ7、GJ8、GJ10、GJ14、GJ15、GJ18、GJ19、GJ21、GJ22、GJ25、GJ27。

2.1.2筛选枸杞徒长枝中的优良乳酸菌 15株乳酸菌的生长曲线如图1所示，部分菌株在4 h后就进入对数生长期，第8 h到达生长顶峰，随后进入平台期。第8 h的OD值以GJ18、GJ2、GJ83株菌的最大，分别为1.71、1.48、1.30，说明GJ2、GJ8、GJ183株菌的生长速率快；据产酸速率曲线如图2，大部分菌株随着生长不断产酸，在第16 h的pH最低，大都在3.90～4.20之间，无明显差异。因此，选择生长快、产酸能力较强的GJ2、GJ8、GJ18菌株进入后续试验。

图1 乳酸菌的生长曲线Fig.1 Growth curve of lactic acid bacteria

图2 乳酸菌的产酸速率曲线Fig.2 Acid-producing ability curve of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌的生理生化鉴定

15株乳酸菌在过氧化氢酶触、从葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸产气、明胶液化和H2S产生四个生化鉴定试验结果如表2，各菌株H2O2接触酶显阴性，H2S气体产生呈阳性；明胶液化中仅GJ19、GJ25菌株呈阳性；在葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸产气试验中，各菌株均产酸，但添加葡萄糖时并不产气，添加葡萄糖酸钠时GJ2、GJ18、GJ25乳酸菌产气，初步鉴定GJ2、GJ18、GJ25属异型乳酸发酵菌，菌株青贮发酵后将会产生CO2，底物转化利用率较低；GJ1、GJ3、GJ4、GJ7、GJ8、GJ10、GJ14、GJ15、GJ19、GJ21、GJ22、GJ27属同型乳酸发酵菌，青贮效果更好。

表2 乳酸菌的生理生化鉴定结果Table 2 Result of physiological and biochemical identification of lactic acid bacteria

15株乳酸菌在不同碳水化合物发酵产酸试验的结果如表3，在PY培养基中添加不同碳源培养后，各菌株均可发酵产酸，但菌株的生长速率与产酸能力存在差异，在葡萄糖、果糖、核糖、木糖和鼠李糖(pH在5.6～6.0之间)中表现最好，在麦芽糖、蔗糖、半乳糖、苦杏仁苷(pH在6.0～6.3之间)中次之；在甘露醇、山梨醇和纤维二糖中最差(pH在6.3～7.2之间)，但菌株GJ2除外；说明各菌株的发酵产酸情况为：糖类物质>某些苷类碳水化合物>醇类物质。

表3 乳酸菌的碳水化合物发酵试验结果Table 3 Results of carbohydrate fermentation experiment of lactic bacteria

2.3 青贮枸杞徒长枝的感官质量评价

以3种生长快、产酸能力强的菌株和亚芯秸秆青贮菌剂作为添加剂，青贮枸杞徒长枝的感官评价结果如表4所示。4种青贮枸杞徒长枝感官评定等级均为良好，说明乳酸菌GJ2、GJ8、GJ18和亚芯秸秆青贮剂感官无显著差异，各分项指标中除水分外，色泽、气味、质地、pH等指标也无显著差异，水分指标中以GJ8菌株青贮最低。但4种菌剂青贮pH均偏高，故需优化枸杞徒长枝青贮材料的预处理措施及其他工艺环节。

表4 添加不同菌剂青贮枸杞徒长枝的感官质量评价结果Table 4 Evaluation of sensory quality of epicormic silage of Goji inoculated with different microbial inoculates

2.4 青贮枸杞徒长枝营养成分的含量分析

以3种生长快、产酸能力强的菌株和亚芯秸秆青贮剂作为添加剂，青贮枸杞徒长枝营养成分的含量分析,结果如表5所示，3种菌剂青贮中粗蛋白、酸性洗涤纤维和对照亚芯秸秆青贮菌剂无显著差异，其余营养成分指标均有差异。粗蛋白含量在1.68%～1.86%之间，酸性洗涤纤维含量在75.31%～78.34%之间；GJ8和亚芯青贮的粗灰分含量最高，与GJ2和GJ18差异显著；GJ8、GJ2与亚芯青贮的中性洗涤纤维和可溶性碳水化合物含量最高，三者之间无显著差异，但GJ18显著较低；GJ8青贮的氨态氮最高，显著高于其余3种菌剂；在干物质含量指标上，GJ8却显著低于其余3种菌剂；亚芯和GJ18青贮的pH显著低于GJ2和GJ8青贮；综合考虑9个营养指标，GJ8的青贮效果最优。

表5 添加不同菌剂青贮枸杞徒长枝中营养成分的含量Table 5 Contents of nutrients in epicormic silage of Goji inoculated with different microbial inoculates

2.5 青贮枸杞徒长枝活性成分的含量分析

以3种生长快、产酸能力强的菌株和亚芯秸秆青贮菌剂作为添加剂,青贮枸杞徒长枝活性成分含量分析结果如图3，亚芯、GJ8、GJ18青贮中枸杞多糖含量在26.54～27.72 mg·g-1间，无显著差异，显著高于GJ2(22.24 mg·g-1)青贮；亚芯青贮的总黄酮含量最高(1.09 mg·g-1)，GJ8青贮(0.923 mg·g-1)次之，二者均显著高于GJ18(0.70 mg·g-1)、GJ2(0.76 mg·g-1)青贮；亚芯和GJ8青贮的甜菜碱含量在6.01～6.13 mg·g-1间，也显著高于GJ18(4.49 mg·g-1)、GJ2(3.74 mg·g-1)青贮。从3个枸杞活性成分指标看，GJ8的青贮效果与亚芯相近，优于GJ2和GJ18青贮，故菌株GJ8可选作后续开发枸杞饲料的专用菌剂。

2.6 菌株的分子鉴定

菌株GJ8的生长速率、产酸能力和青贮效果最好，可作为青贮枸杞徒长枝生产饲料的专用菌剂。GJ8菌株经细菌16S rDNA序列分析构建系统发育树(图4)，GJ8菌株和乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)聚在一起，且节点支持度只有44%。因此，16S rDNA显示GJ8菌株为乳酸片球菌，显微也显示球状细胞(图5)。

注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters in the figure indicate significant difference (P<0.05).图3 各菌剂青贮枸杞徒长枝中药用活性成分含量Fig.3 Content of the active pharmaceutical ingredients in Goji silage

图4 基于GJ8菌株16S rDNA序列的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of stain GJ8

图5 菌株GJ8的细胞显微形态(10×40倍)Fig.5 Microscope type of GJ8 cells(10×40 times)

3 讨论

决定青贮饲料品质优劣的关键取决于乳酸菌能否迅速生长并大量繁殖、能否快速产生大量有机酸使生长环境的pH迅速下降，从而保证营养物质的损失率达到最小。人为添加乳酸菌进行青贮，可以改变青贮饲料内的微生物体系，使乳酸菌成为主要功能菌，进而调控青贮发酵，以提高青贮饲料的品质。与商品青贮菌剂相比，植物上附着的天然乳酸菌适应性强，更能高效利用植物营养进行发酵。因此，较多研究针对植物上附着的天然乳酸菌进行分离，其中部分菌株表现出较好的功能[24-27]。本研究从枸杞徒长枝叶中上筛选筛出3株生长快、产酸能力强的乳酸菌应用于青贮枸杞徒长枝时的效果好，较底物上附着的其他杂菌的适应性更好，其生长优势及产酸优势能最大程度抑制其他微生物，如霉菌、酵母菌等生长呼吸对底物的消耗，延长底物的保存时间。其中，GJ8菌株作为菌剂，青贮枸杞徒长枝中营养成分含量优于商品菌剂，其感官评价和药用成分含量与商品菌剂相近，因此，可以作为后续开发枸杞青贮专用菌剂候选菌株。

目前，已从玉米、苜蓿、甜高粱、黑麦草等常见青贮底物中分离获得青贮过程中的优势菌，大多分布乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)[13-15]。而本研究筛选获得的最优菌株GJ8菌株也属于片球菌属。

青贮枸杞徒长枝中含有普通牧草欠缺的药用活性成分，比如枸杞多糖、甜菜碱、黄酮等物质，枸杞多糖可有效降低血脂和血糖，抗肿瘤、保护肝脏，增强机体免疫；甜菜碱可为机体提供-CH3；黄酮能使机体促生大量新的肝细胞，增强心脏收缩、减少心脏搏动数及抗氧化。梁小军等[6]研究表明，饲喂家禽或反刍动物可明显提高畜产品的品质，故以枸杞徒长枝生产青贮饲料不仅变废为宝，也可开发为独特的中药饲料添加剂。若在完善预处理措施，如选取鲜嫩少刺的徒长枝、预先碾压柔化、加强密封、添加纤维素酶或其他乳酸菌复合青贮等，生产枸杞徒长枝中药饲料添加剂，其市场前景十分可观。