高通量测序分析蚕豆种子内生细菌的多样性

刘璐, 名晓东, 张晓艳, 郝俊杰, 付丽平, 王乾坤, 吕鑫, 陈旺, 刘全兰*

(1.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院， 山东 青岛 266042; 2.青岛市农业科学研究院， 山东 青岛 266100)

蚕豆(ViciafabaL.)属豆科蝶形花亚科野豌豆族野豌豆属，起源于亚洲西南部和非洲北部[1-2]。蚕豆营养丰富，含有蛋白质、糖类、脂质、膳食纤维以及钙、铁、胡萝卜素、维生素等；蚕豆中含有人体中不能合成的8种必需氨基酸，其中赖氨酸含量较高[3]。蚕豆还有利湿消肿、清热健脾、促进骨骼生长的作用；其含有的脑磷脂和胆碱是大脑和神经组织的重要组成成分[4]。不仅如此，蚕豆还在饲料和绿肥领域具有广泛的用途，这些优点使蚕豆受到联合国粮农组织的支持发展。中国是蚕豆种植面积较大的国家之一，青海、甘肃和云南等省区是主要种植地区。张小娟等[5]分析了青海省不同生态区蚕豆主栽品种青蚕 14 中的6个根瘤菌株，发现它们分属 4 个菌属；Saïdi等[6]从蚕豆根瘤中分离了104株内生细菌，其中9株菌回接后可提高蚕豆的生物学产量，这些研究表明蚕豆中内生细菌含量丰富。

植物内生菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段定殖于植物器官、组织内部、细胞间隙以及细胞内的微生物，一般分为内生细菌、内生放线菌及内生真菌等三大类[7- 8]。种子是植物重要的繁殖器官，具有重要的经济价值，也被证实携带有大量的微生物种群[9-11]。基于16S rDNA高通量测序研究种子内生细菌的相关工作已开展，结果表明，水稻种子内生细菌中门水平且丰度大于1%的优势菌群是变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)[12]；玉米种子中的优势细菌群有泛菌属 (Pantoea)、 鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、 不动杆菌属(Acinetobacter)、 假单胞菌属 (Pseudomonas)、 勒克氏菌属(Leclercia)和肠杆菌属(Enterobacter)[11]。内生细菌的种类丰富度因世代传递和种子成熟度而呈动态变化特征，玉米种子内生细菌在上下代传递时表现为父母本种子内生细菌在子代的丰度不同于父母本[11]；成熟与未成熟喜树种子中有共有属水平的细菌，但内生细菌的丰度有差异[13]。本研究选用口感好的两个加工型蚕豆品种为植物材料，利用基于Illumina MiSeq第二代高通量测序技术，探索这两个加工型蚕豆种子内生细菌的种群结构特征和丰度，为蚕豆种子的应用和推广提供内生细菌的数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1蚕豆材料 供试两个蚕豆品种为日本大白皮(S18P23)和启豆2号(S18P24)，种植在青岛市农业科学研究院，采集形态一致的籽粒若干于4 ℃保存备用。每个蚕豆品种选取两粒种子，编号为S18P23.1、S18P23.2、S18P24.1、S18P24.2。

1.1.2主要试剂 DNA marker、Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer、Mg2+购自生工生物工程(上海)股份有限公司；基因组DNA提取试剂盒和PCR产物纯化试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司，其余常规化学试剂均为国产分析纯。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1蚕豆消毒 蚕豆种子放入无菌水中清洗3 min，70%的乙醇冲洗3 min，再用无菌水冲洗掉种子表面的乙醇。取最后一次清洗蚕豆的无菌水100 μL涂布于TSA固体培养基中，28 ℃培养72 h，用以检测灭菌效果[14]。

1.2.2基因组DNA提取和PCR扩增 消毒的蚕豆种子用无菌研磨杯研磨成粉，混匀。DNA提取试剂盒提取蚕豆粉中细菌基因组DNA，无菌水稀释DNA浓度至 10 ng·μL-1左右。以稀释后的基因组DNA为模板，选择16S rRNA V3～V4区(343F： 5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)，使用带Barcode的特异引物和ExTaq高保真酶进行两轮PCR扩增。 第一轮PCR反应体系: 2 μL 10×PCR Buffer，2.0 mmol·L-1Mg2+，200 μmol·L-1dNTPs，3×10-6μmol引物，45 ng模板DNA， 1.5 UExTaq高保真酶，灭菌双蒸水以补足至20 μL。第一轮PCR扩增程序：85 ℃ 5 min，50 ℃ 1 min，65 ℃ 3 min； 94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，67 ℃ 2 min，15个循环； 67 ℃ 5min。PCR 产物经电泳检测后使用磁珠纯化，将磁珠摇匀悬浮，10 μL 扩增产物 和 18 μL 磁珠悬浮液混匀后，室温孵育 5 min后放到磁力架上，按照OMEGA试剂说明书进行纯化。纯化后的产物作为第二轮 PCR 模板进行二次扩增， 扩增体系和程序同第一轮，其中循环数为10个。检测合格的 PCR 产物使用磁珠纯化，纯化后对 PCR 产物进行 Qubit 定量。每一个样品二轮PCR扩增分别做三次重复，三次 PCR 扩增产物浓度调整为相同水平，等量混样送上海欧易生物医学科技有限公司进行测序。

1.2.3生物信息分析 Illumina MiSeq 测序生成原始双端序列数据，以 FASTQ 格式存储。使用 Trimmomatic 软件对原始双端序列进行去杂，去除含有模糊碱基(ambiguous)、单碱基高重复区(homologous)的序列以及长度过短的序列，去杂后的双端序列用 FLASH 软件进行拼接[15]。同时，利用 UCHIME 检测并去除序列中的嵌合体序列[16]。测序数据进行预处理生成优质序列之后，根据序列的相似性，采用 Vsearch 软件将序列归为多个 OTU。序列相似度≥97%被归为一个 OTU 单元[17]。使用 QIIME 软件包[18]挑选出各个 OTU 的代表序列，并将所有代表序列与 Greengenes 或者 Silva 数据库进行比对注释[19-20]，去除注释为叶绿体、线粒体及非细菌界的 OTUs。Mother 软件做稀释曲线分析[21]，通过对 OUT 进行丰度和α -多样性分析，得到微生物细菌群落结构组成及多样性特征；物种比对注释使用 RDP classifier 软件，保留置信区间>0.7 的注释结果。

2 结果与分析

2.1 序列长度分析

表面消毒的蚕豆种子在培养基上于28 ℃温度下培养48 h，无菌落生长，说明试验中的蚕豆种子消毒彻底。蚕豆种子内生菌总DNA经

16S rRNA V3～V4区特异性PCR扩增，均获得大小为700 bp左右的目的片段。PCR产物测得的序列在去除引物接头序列和两端信号不佳的序列后拼接拼接后的序列长度在400 bp左右。两个蚕豆品种的四粒种子中共测得155 408条原始序列，经拼接和过滤处理后，获得133 855条优化序列，两个品种的样品优化序列数目较为接近(表1)。序列长度主要分布在400～ 450 bp 范围内 (图1)，与 16S rRNA V3～V4 区序列长度大致吻合。

表1 蚕豆种子内生菌序列Table 1 Sequence number of endophytic genomes from faba bean seeds

图1 蚕豆种子内生细菌扩增序列长度特征Fig.1 Length character of sequence of endophytic genome from faba bean seeds

2.2 操作分类单元OTU数目统计

从蚕豆种子中共获得1 598个细菌OTUs，不同品种间 OTUs 数量存在差异(图2)。日本大白皮S18P23.2中的内生细菌OTUs 数最高，达487个；日本大白皮S18P23.1中内生细菌 OTUs 数含量为371个；启豆S18P24.1中内生细菌OTUs数374个，启豆S18P24.2中内生细菌 OTUs 数366个。这两个蚕豆品种的四粒种子里有66个共有的 OTUs；日本大白皮的两粒种子S18P23.1和S18P23.2中共有145个OTUs，启豆的两粒种子S18P24.1和S18P24.2中共有129个OTUs。可见，两个蚕豆品种中含有丰富的内生细菌种类，品种间共有的核心菌群小于品种内共有的核心菌群。

图2 不同蚕豆品种种子内生细菌OTUs的分布Fig.2 Statistics of the number of OTUs in faba bean seeds

2.3 蚕豆种子内生细菌16S rRNA序列的测序深度和多样性分析

基于OTU的稀释曲线结果显示，随着测序数量的增加，稀释曲线斜率逐渐降低，趋于平坦，且所有样品均已进入平台期，说明测序数量已经足够大，可以基本反映样品中绝大多数微生物信息，Good coverage曲线显示蚕豆样品的测序深度均达到99%以上(图3)。

Chao 1指数可反映内生细菌群落丰富度(community richness)，从表2可以看出S18P24.1的群落丰富度最高， S18P24.2的丰富度为其次，S18P23.2的丰富度为最低。内生细菌群落的丰富度和均匀度可通过Shannon指数得到反映，如同Chao 1指数反映的规律，S18P24.1的群落多样性度最高，S18P24.2次之，S18P23.2最低。

图3 蚕豆种子内生细菌16S rRNA序列覆盖度Fig.3 16S rRNA sequence converage of endophytic bacterial genomes from faba bean seeds

2.4 群落结构组成分析

2.4.1内生细菌门水平上的群落结构组成分析

从门的分类水平看，2个蚕豆品种中内生细菌共检测出17个门，蚕豆品种间内生细菌所测到的细菌门种类相似，但其在各品种中所占比例不同(图4)。整体而言，数量最多的5个门为拟杆菌门(Bacteroidetes，30%～33%)、变形菌门(Proteobacteria， 23%～25%)、厚壁菌门(Firmicutes， 23%～25%)、放线菌门(Actinobacteria， 5%～7%)。可见，拟杆菌门的比重最高，是优势门。软壁菌门(Tenericutes)等常见细菌门在蚕豆种子中含量较少。

2.4.2内生细菌属水平上的群落结构组成分析

按照至少在1 个种子中丰度≥1%的特征，所有OTU总共归于拟杆菌属(Bacteroides， 8%～17%)、乳杆菌属(Lactobacillus， 7%～17%)、芽孢杆菌属(Bacillus，丰度为6%～13%)、棒杆菌属(Corynebacterium， 6%～11%)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella， 4%～14%)、普雷沃氏菌属(Prevotella，1%～26%)、不动细菌属(Acinetobacter， 1%～23%)、梭杆菌属(Fusobacterium，2%～8%)、奈瑟菌属(Neisseria， 2%～7%)、肠杆菌属 (Enterobacter，2%～6%)、链球菌(Streptococcus，2%～4%)、Lachnoclostridium(1%～3%)等24个优势细菌属(图5)。日本大白皮蚕豆SP23.1的优势细菌菌属是普雷沃氏菌属，其丰度为26%左右；日本大白皮蚕豆SP23.2的优势细属是不动细菌属，其丰度为23%左右。启豆蚕豆SP24.1的优势细菌菌属是拟杆菌属和乳杆菌属，其丰度均为17%左右；启豆蚕豆SP24.2的优势细菌菌属是拟杆菌属，其丰度为17%左右。从细菌菌属的丰度分布看，日本大白皮蚕豆SP23两粒种子内生细菌的丰度在品种内和品种间都有显著不同的差异；相比较而言，启豆蚕豆SP24两粒种间子内生细菌丰度的差异性低于日本大白皮蚕豆SP23。

表2 蚕豆种子内生细菌16S rRNA测序深度和多样性Table 2 Sequencing depth and sequence diversity of 16S rRNA of endophytic bacterial genomes from faba bean seeds

图4 蚕豆种子内生细菌门的相对丰度分布Fig.4 Relative abundance distribution of endophytic bacteria at phylum levelin faba bean seeds

图5 蚕豆种子内生细菌属水平的相对丰度Fig.5 Relative abundance of endophytic bacteria at genus level in faba bean seeds

3 讨论

高通量技术在植物内生菌研究中具有明显优势，利用Illumina MiSeq第二代高通量测序技术分析16S rRNA，从基因组水平上解析微生物群落结构，可以检测到传统方法难以检测到的菌群。本研究发现，两个蚕豆品种种子内生细菌的优势菌门为拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、放线菌门，这与其他植物种子内生菌的优势菌门略有不同。如，水稻种子内生菌的优势菌门是变形菌门、厚壁菌门和放线菌门[12]，这说明植物类型影响种子内生菌的种类和丰富度。拟杆菌门包括拟杆菌纲(Bacteroidia)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)三大类细菌[22-24]，黄杆菌在番茄中高丰度的存在将有利于番茄抵抗土壤的病原体青枯菌[25]。变形菌门均为革兰氏阴性菌，既有好氧菌也存在厌氧菌，既有自养型也有异养型，既存在光能型也存在化能型；根据rRNA序列，传统上被分为五个纲，用希腊字母α、β、γ、δ、ε和ζ命名，它们在农业、工业、医药、卫生、环保等领域具有重要应用价值[22-24]。厚壁菌门的细菌多数为革兰氏阳性，菌体以球状或杆状为主，主要包括芽孢杆菌纲、梭菌纲、丹毒丝菌纲、热石杆菌纲等，其中芽孢杆菌纲和梭菌纲是厚壁菌门的两大主体[22-24]。放线菌门包括具有细菌形态的放线细菌和菌丝较为丰富的经典放线菌[26],只有一个放线菌纲 (Actinobacteria)。放线菌纲包括酸微菌亚纲 (Subclass Acidimicrobidae)、红细菌亚纲 (Subclass Rubrobacteridae)、红蝽菌纲 (Subclass Coriobactridae)、球杆菌亚纲(Subclass Sphaerobacteridae)、放线菌亚纲 (Subclass Acinobacteridae)5个亚纲。这5个亚纲的特征预示着蚕豆种子内生菌具有丰富的种群多样性。

本研究进一步揭示了蚕豆种子内生细菌丰度在1%以上的属有24个属，四粒种子中内生细菌丰度在4%以上的属有拟杆菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属和拟普雷沃菌属5个属，丰度在2%～8%的属有梭杆菌属、奈瑟菌属、肠杆菌属和链球菌4个属，丰度差异大的属有普雷沃氏菌属和不动细菌属。陈泽斌等[27]研究表明，花生仁内生细菌主要有食酸菌属(Acidovorax，83. 33%) 和希瓦氏菌属(Shewanella，16.67%)；玉米种子内生细菌的种类主要包括鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土地杆菌属(Pedobacter)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、盐单胞菌属(Halomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella)6个属[28]； 刘媛等[29]研究表明，棕榈科不同植物的优势内生细菌属不同，蒲葵种子中的优势细菌为芽孢杆菌属(丰度45.8%)，棕榈种子的优势菌属为肠球菌属(51.2%)，山棕种子的优势细菌属为肠球菌属(12.1%)，短穗鱼尾葵种子的优势细菌属为肠球菌属(32.6%)，三药槟榔种子的优势细菌属为肠球菌属(42.9%)，软叶刺葵种子的优势细菌属为肠球菌属(28.3%)，加拿利海枣种子的优势细菌属为糖多孢菌属(31.2%)。这些结果说明，不同植物种子内生细菌有差异，这种差异的机制尚需进一步研究。

日本大白皮两粒种子内生细菌在属水平的丰度上存有明显差异，两粒种子中优势属不同。日本大白皮SP23.1的优势菌普雷沃氏菌属属于拟杆菌门普雷沃氏菌科，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)在甘蔗糖蜜中的含量为2.1%±0.9%，它们在糖蜜添加到土壤的3 d后成为土壤的优势菌(328 OTUs)，36 d后仅有6个OTUs[30]，这些研究结果说明，普雷沃氏菌属易因营养物质的变化而发生大的波动。日本大白皮SP23.2的优势菌不动菌属属于变形菌门变形菌纲莫拉菌科(Moraxellaceae)，Shi等[31]从甜菜中分离的不动杆菌属Acinetobacterjohnsonii3-1菌株有促进甜脆根生长的特性，Chen 等[32]从东南景天分离的内生菌AcinetobactercalcoaceticusSasm3对硝酸镉土壤有修复作用, Carvalheira 等[33]从生菜新鲜叶子、苹果、梨、香蕉和草莓中分离的不动杆菌属物种对多种抗生素有抗性，表明不动杆菌属是植物中的常见内生细菌。本研究中两粒日本大白皮种子内生细菌在优势菌属和菌属丰度上的差异，推测原因有两个：一是高通量测序时取样部位的差异导致了测序结果的差异；二是日本大白皮种子内生细菌易受外界环境影响。

两粒启豆2号种子的内生细菌在属水平丰度上也存有一定差异，SP24.1的优势属是乳杆菌属和拟杆菌属，SP24.2的优势属是拟杆菌属。与日本大白皮种子内生菌的特征相比较，启豆2号种子中内生菌的益生菌含量更丰富。乳杆菌是许多作物种子的内生细菌，如草莓果实[34]和小麦种子[35]等均有乳杆菌内生菌的报道。近10年来，乳酸菌已成为有效的生物肥料、生控剂和生物刺激剂[36]，作为生物肥料，乳酸菌可提高来自有机肥和其他有机材料的营养物的供给；作为生物防控剂，乳酸菌还对广谱的真菌和细菌病原菌有防控效果；作为生物刺激素，乳酸菌可以促进植物生长或种子发芽，减轻各种非生物压力。拟杆菌属是下一代益生菌，拟杆菌门在健康成年人体内肠道菌群中的占比为20%～80%，拟杆菌纲是人体肠道革兰氏阴性菌中含量最丰富的菌群(109～1011CFU·g-1粪便)[37-38]。启豆2号蚕豆种子中含有大量的拟杆菌属，说明这些种子有一定的益生功能。

本研究从两个蚕豆品种的4粒种子中共获得133 855条优化序列，获得1 598个细菌OTUs，4粒种子内生细菌群落丰度在属水平上有差异，但这些菌群对蚕豆种子品质和发育的影响尚不清楚，应进一步开展这些菌群代谢和功能的研究以便于揭示蚕豆-内生细菌协作机制和规律。