某鸭场鸭疫里默氏杆菌病实验室诊断

袁标 邓珊珊 张海 蔺俐仲 袁林 罗登荞 景书灏 徐春志 杨源 刘艳

（1，贵州省贵阳市息烽县农业农村局 551100；2，贵州省贵阳市清镇市农业农村局 551400；3，贵州省贵阳市动物疫病预防控制中心 550081；4，贵州省贵阳市草地站 550081）

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌引起的以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎为主要临床特征的急性、败血性、接触性传染病，又称为鸭传染性浆膜病。该病的易感动物有鸡、鸭、火鸡等，其中对2～3 周龄雏鸭最易感染[1]。Riemer 等1904 年首次报道鸭疫里默氏杆菌，随后相继在世界各国都有发生。我国郭玉璞等[2]1982 首次在北京郊区鸭场中分离到鸭疫里默氏杆菌，全国都有相关报道，如今已成为危害养鸭产业发展的重要疾病之一。

贵州省某鸭场购进雏鸭11000 只，6 日龄引种于四川省隆昌市，饲养至11 日龄时开始发病死亡，鸭群16 日龄时已死亡8000 余只。病鸭临床症状以神经症状为主，出现摇头晃脑、行动迟缓、站立不稳、精神沉郁、被毛凌乱等，部分患鸭头颈歪斜、卧地不起。剖检病死鸭可见脑组织水肿、心脏表面有灰白色包膜、病鸭脾脏肿大腹内有黄色纤维素性渗出物、附关节肿大等大体病变。初步怀疑为鸭疫里默氏杆菌感染，为进一步确诊该养鸭场雏鸭异常死亡的病因，采用了细菌分离鉴定、PCR检测、药敏试验实验室诊断方法，为后期防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 病料

选择患病雏鸭5 只，无菌采集心包液、肝脏组织。

1.2 主要试剂和培养基

2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL2000、细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；新生牛血清（购于浙江天杭生物科技有限公司）；试验所用的抗菌药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；巧克力培养基实验室自制。

1.3 细菌分离培养

分别无菌接种5 只受检鸭的心包液、肝脏组织于巧克力琼脂平板，置于烛缸中37℃恒温厌氧培养24h。

1.4 细菌PCR 检测

挑取纯化培养的单个菌落到5%新生牛血清的液体培养物中，震荡过夜培养。参照细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌总DNA。根据鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A (OmpA) 基因设计特异性引物。上游引物：5’ -AGCCAACTATTTGAGACACG-3’；下游引物：5’-ATACCCTTTAATGCTCCTG-3’，预扩增片段663 bp。采用25 μL 反应体系进行PCR 扩增，扩增程序为95℃预变性3min，然后进入95℃变性45s、54℃退火45s 和72℃延伸45s 的35 次循环，最后72℃再延伸10min。扩增产物进行电泳检测，观察是否有特异性目的条带。

1.5 细菌药敏试验

药敏试验采用药敏纸片琼脂扩散法，参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的标准进行，药敏结果判断标准按NCCLS2010 年标准，作出结果判断。

2 结果

2.1 细菌分离培养及形态

巧克力琼脂平板生长出表面光滑湿润、边缘整齐、半透明呈露滴状菌落，见图1。挑取单个菌落进行纯培养，经革兰氏染色，镜检显示分离菌为革兰氏阴性短小杆菌，见图2。初步判断为鸭疫里默氏杆菌。

图1 分离菌的菌落形态

图2 分离菌革兰氏染色镜检图

2.2 细菌PCR 鉴定

取PCR 扩增产物8μl，于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统观察，结果显示，鸭疫里默氏杆菌阳性对照和分离菌样本在663bp 处均出现特异性条带，结果见图3，可得本次厌氧分离得到的细菌为鸭疫里默氏杆菌。

2.3 细菌药敏试验

图3 分离菌PCR 扩增结果

选取分离得到的鸭疫里默氏杆菌分离株进行药敏试验，结果为分离菌对头孢呋辛、头孢唑啉、氨苄西林、羧苄西林、克林霉素、麦迪霉素、万古霉素、庆大霉素、新霉素和丁胺卡那等9 种抗菌药物均呈现不同程度的耐药性，而对头孢氨苄、头孢哌酮、头孢拉定、头孢他啶、哌拉西林、氧氟沙星、诺氟沙星和米诺环素等8 种抗菌药物呈现良好的敏感性，部分结果如图4 所示。

图4 部分药敏试验结果

3 结论

采用细菌分离鉴定、PCR 检测、药敏试验实验室诊断方法，确诊该养鸭场雏鸭异常死亡的病因为鸭疫里默氏杆菌感染。药敏试验发现，分离菌对头孢氨苄、头孢哌酮、头孢拉定、头孢他啶、哌拉西林、氧氟沙星、诺氟沙星和米诺环素等8 种抗菌药物呈良好的敏感性。

4 讨论

鸭疫里默氏杆菌世界上公认的血清型有21 个，国内流行的是1 型和2 型[3]，其他血清型也常常伴随发生，且不同血清型直接无交叉免疫保护，这给疫苗免疫预防带来了困难。在临床上主要采用抗生素药物进行治疗，但由于大量抗生素药物的滥用，造成不同程度的耐药。因此，选择合适的敏感药物对治疗和预防鸭疫里默氏杆菌病显得至关重要。同时要加强环境卫生清洁和消毒，注意交替使用消毒药物，避免产生耐药性影响消毒效果[4]。对鸭群还要注意保暖，较少应激，做好禽流感和鸭瘟等疫病的免疫工作，加强免疫抗体监测。