家蝇抗真菌肽-1A对人肝癌细胞HepG2抑制作用的机制*

吴坤， 马晓琳， 张迎春， 邓思波， 黄敏慧， 吴建伟， 陈峥宏**， 王涛**

(1.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.济南金域医学检验中心， 山东 济南 250000)

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是广泛存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害的一类小分子多肽，是生物固有免疫系统的重要组成成分[1-2]。研究发现，AMPs除了具有抑制细菌、病毒等病原微生物作用外，对肿瘤细胞也具有较强的抑制活性[3-6]，而且对机体正常组织细胞的毒副作用较低[7-8]，因此具有抗肿瘤药物开发的潜力。家蝇抗真菌肽-1A (Muscadomesticaantifungal peptide-1A，MAF-1A) 是来源于家蝇幼虫的小分子阳离子活性多肽，由26个氨基酸残基组成[9]。有研究报道，MAF-1A能杀伤真菌、病毒等致病性微生物[10-11]；课题组前期实验研究发现，MAF-1A能对人肝癌HepG2产生抑制作用，且对人正常肝细胞LO2和红细胞无明显毒性作用，具有进一步研究开发的价值[12]。但MAF-1A抑制HepG2细胞的作用机制尚不清楚，本研究旨在探讨MAF-1A对HepG2细胞产生抑杀作用的可能因素，为MAF-1A的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株和主要试剂 人肝癌细胞HepG2由贵州医科大学生物工程实验室惠赠；杜氏改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM) 及磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS；美国GIBCO)，胎牛血清(杭州四季青)，活性氧(reactive oxygen species，ROS) 检测试剂盒及Annexin V-FITC试剂盒(北京索莱宝)，细胞周期检测试剂盒及线粒体膜电位检测试剂盒(上海碧云天)。

1.1.2主要仪器 Novo Cyte流式细胞仪(杭州艾森)，H-600-4透射电子显微镜(日本日立高新)，XDS-1B倒置显微镜(重庆光学)，MCO-5M CO2培养箱(日本三洋)及L500台式低速离心机(湖南湘仪)。

1.2 方法

1.2.1MAF-1A储备液的制备 按文献[13]方法，采用原核载体串联表达MAF-1A，镍柱亲和层析纯化、脱盐浓缩制备MAF-1A，使其储备液浓度为5 000 mg/L，分装后置于-80 ℃冰箱冷藏备用。

1.2.2细胞培养 HepG2细胞培养于DMEM完全培养基，含体积分数10%胎牛血清，培养基添加终浓度100 000 U/L青霉素及100 mg/L的链霉素；将细胞置于5%CO2的37 ℃培养箱中培养，细胞密度达到80%时，按照1 ∶3的比列传代，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.3透射电镜观察细胞超微结构 取对数生长期的HepG2细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔板，置5%CO2的37 ℃细胞培养箱培养12 h；0、50 及100 mg/L的MAF-1A分别处理24 h后收集细胞，3%戊二醛固定、丙酮逐级脱水、样品包埋，切完片后先后用醋酸铀和枸橼酸染色，于透射电镜(6 000×)下观察细胞的超微结构。

1.2.4流式细胞术测定细胞周期、细胞凋亡及细胞内ROS 取对数生长期的HepG2细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔板，每组3个复孔，5%CO2的37 ℃培养箱培养12 h；0、100、200及400 mg/L的MAF-1A分别处理24 h。按试剂盒说明书方法，分别以碘化丙啶(propidium lodide，PI)、Annexin V-PI试剂、DCFH-DA(10 μmol/L)溶液处理细胞后，再用流式细胞仪分别检测HepG2细胞的周期、凋亡及细胞内ROS 水平。

1.2.5JC-1荧光探针检测线粒体膜电位 取对数生长期的HepG2细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔板，放入5%CO2的37 ℃细胞培养箱培养12 h； 以终浓度为0、100、200及400 mg/L的MAF-1A处理细胞24 h，加入JC-1染色工作液混匀，37 ℃孵育20 min，不含胎牛血清的培养基洗涤3次，胰酶消化，1 000 r/min离心3 min收集细胞，流式细胞仪检测HepG2细胞线粒体膜电位。

1.3 统计学分析

0 mg/L MAF-1A组 50 mg/L MAF-1A组 100 mg/L MAF-1A组注：黑色箭头分别表示细胞膜出芽、核固缩，凋亡小体，白色箭头分别表示染色质出现边集，胞浆固缩、空泡化。图1 不同浓度MAF-1A对HepG2细胞形态的影响(6 000×)Fig.1 Effects of different concentrations of MAF-1A on the morphology of HepG2(6 000×)

2 结果

2.1 电镜观察

透射电镜观察可见，经不同浓度的MAF-1A作用后，HepG2细胞体积较对照组缩小，细胞膜产生出芽现象，核固缩，有凋亡小体形成；染色质出现边集，胞浆固缩、空泡化；而阴性对照组细胞规则，胞膜未见形态变化，未见核固缩、胞浆浓缩等现象。见图1。

2.2 细胞周期

检测结果显示，与0 mg/L组相比，MAF-1A各浓度组中G0/G1期的HepG2细胞比例升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 不同浓度MAF-1A对HepG2细胞周期的影响Tab.1 Effects of different concentrations of MAF-1A on cell cycle of

2.3 细胞凋亡率

100、200及400 mg/L的MAF-1A作用24 h后，HepG2细胞凋亡率较0 mg/L MAF-1A组明显增大，且凋亡率随MAF-1A浓度的升高而增加(P<0.01)。见图2。

注：A为凋亡细胞检测结果，B为细胞凋亡率的定量结果；(1)与0 mg/L MAF-1A组比较，P<0.01。图2 不同浓度MAF-1A对HepG2细胞凋亡的影响Fig.2 Effects of different concentrations of MAF-1A on apoptosis of HepG2 cells

2.4 线粒体膜电位

100、200及400 mg/L 的MAF-1A分别作用24 h后，与对照组(0 mg/L组)相比，HepG2细胞的线粒体膜电位可降低，并且随着MAF-1A浓度的升高，出现线粒体膜电位下降细胞数的占比逐渐增高。见图3。

0 mg/L MAF-1A组 100 mg/L MAF-1A组 200 mg/L MAF-1A组 400 mg/L MAF-1A组注: 正常线粒体膜电位细胞分布于右上Q2-2区域，线粒体膜电位下降的细胞分布在右下Q2-4区域。图3 不同浓度MAF-1A对HepG2细胞线粒体膜电位的影响Fig.3 Effects of different concentrations of MAF-1A on mitochondrial membrane potential of HepG2 cells

2.5 ROS

结果显示，与0 mg/L MAF-1A组相比，高浓度MAF-1A(400 mg/L)组HepG2细胞内ROS水平明显升高(P<0.01)，但中、低浓度MAF-1A(100和200 mg/L)组ROS水平的差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

注：A为细胞内ROS检测结果，B为细胞内ROS的定量表达；(1)与0 mg/L MAF-1A组比较，P<0.01。图4 不同浓度MAF-1A对HepG2细胞内ROS的影响Fig.4 Effects of different concentrations of MAF-1A on ROS in HepG2 cells

3 讨论

目前研究认为，AMPs的抗肿瘤机制包括诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抗血管形成、溶膜作用及改变细胞离子通道等[14-17]，其中诱导细胞凋亡是AMPs抑杀肿瘤细胞的主要机制之 一[18]。细胞调亡是细胞为更好地适应生长环境而发生的自发的程序性死亡，与肿瘤的发生、发展及治疗密切相关[19-20]。文献报道，细胞在调亡过程中可出现细胞膜皱缩、细胞膜出芽、细胞核边集、细胞器的碎片及染色质的固缩或碎片等特征性的形态学变化[21-22]。本研究的透射电镜检测结果显示，HepG2细胞经MAF-1A作用后，产生了染色质聚集或边集，核固缩，形成凋亡小体等细胞凋亡的特征性变化，提示MAF-1A抑制肿瘤活性机制作用可能与细胞凋亡相关；进一步通过流式细胞术检测细胞凋亡率发现，不同浓度MAF-1A均可促进HepG2细胞的凋亡，且浓度越高，细胞凋亡率越大(P<0.01)，表明MAF-1A可诱导HepG2细胞凋亡的发生，提示MAF-1A可以通过诱导HepG2细胞凋亡，从而抑制HepG2细胞的增殖。

细胞凋亡过程受多条信号转导通路的调节，随着对凋亡机制研究的深入，普遍认为线粒体是介导细胞凋亡的执行者，而线粒体膜电位降低是细胞发生凋亡最早期的变化，一旦线粒体膜电位出现降低，细胞进入凋亡程序[23]。有研究认为，ROS是细胞新陈代谢的产物，在细胞凋亡的发生发展过程中起着重要的作用[24]。文献报道，Cecropin A及Tomentosin可通过下调线粒体膜电位和增加细胞内ROS含量诱导HeLa细胞凋亡[25]。本实验研究结果显示，在MAF-1A作用下 HepG2细胞线粒体膜电位降低，且高浓度MAF-1A(400 mg/L)组HepG2细胞内的ROS水平明显升高，表明MAF-1A可以下调HepG2细胞的线粒体膜电位，并且在一定浓度下可诱导细胞内ROS大量产生，提示下调线粒体膜电位及促进细胞内ROS的产生可能是MAF-1A诱导 HepG2 细胞凋亡的原因。

通常认为肿瘤细胞的细胞周期包括2个时期，即有丝分裂间期和有丝分裂期(M期)[26]。有丝分裂间期又可划分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)，细胞还未进入分裂期时，处于静止的状态称G0期[27]。研究发现，当肿瘤细胞周期中的任何一个时期受到阻滞，可以导致肿瘤细胞增殖受阻[28]。实验研究报道，来源于蜘蛛的毒液肽可通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡，从而抑制HeLa细胞的生长[29]。本研究的细胞周期检测结果显示，不同浓度的MAF-1A均能使HepG2的G0/G1期细胞所占比例升高(P<0.01)，表明MAF-1A可将细胞周期阻滞于G0/G1期。

综上所述，本研究认为MAF-1A可能通过促进线粒体膜电位下调、增加细胞内ROS含量所介导的细胞凋亡，以及阻滞细胞周期来发挥抑制HepG2细胞的作用。