黏质沙雷氏菌Serratia marcescens Ha1对玉米田杂草的室内除草活性测定

李鑫 乔欣 杨娟 杨毅清 马树杰 张利辉 董金皋

摘要 ：为了寻找高效安全的微生物除草剂，本研究以天然存在的黏质沙雷氏菌 Ha1菌株为试验材料，采用发酵液喷施法和颗粒剂封闭法（填埋法和撒施法）对玉米田常见杂草进行了室内活性测定。发酵液喷施法、颗粒剂填埋法和撒施法对杂草的鲜重防效分别为47.88%，70.63%和76.82%。发酵液喷施法和颗粒剂封闭法均能有效防除杂草，颗粒剂封闭法优于发酵液喷施法，颗粒剂撒施法优于填埋法。

关键词 ：黏质沙雷氏菌; 除草活性; 鲜重防效

中图分类号： S 482.7

文献标识码： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019581

Determination of indoor herbicidal activity of Serratia marcescens Ha1 in corn fields

LI Xin1， QIAO Xin1， YANG Juan2， YANG Yiqing1， MA Shujie1， ZHANG Lihui1*， DONG Jingao1

（1. College of Plant Protection， Hebei Agricultural University， Baoding 071000， China; 2. College of Agronomy

and Biotechnology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066600， China）

Abstract ：In order to find efficient and safe microbial herbicides， indoor activity of the naturally occurring Serratia marcescens Ha1 strain on common weeds in maize field by fermentation broth spray method and granule sealing method （landfill method and spreading method）. The fresh weight control efficacies of fermentation broth spray method， granule filling method and spreading method on weeds were 47.88%， 70.63% and 76.82%， respectively. Both the fermentation liquid spraying method and the granule sealing method can effectively prevent weeds. The granule sealing method is superior to the fermentation liquid spraying method， and the granule spraying method is superior to the landfill method.

Key words ：Serratia marcescens; herbicidal activity; fresh weight control

自20世紀70年代化学除草剂大面积推广以来，我国就逐渐形成了以化学防除为主的杂草防除技术体系[1]。虽然化学除草剂在杂草防治中具有诸多优势，但其长期使用所带来的药害、抗性、环境和药物残留等问题也不容忽视[2]。为了保障农业生态环境的可持续发展，农业部提出到2020年化学农药使用量“零增长”计划，广大研究学者逐渐把目光转向了资源丰富、环境友好的微生物除草剂。截至2016年底，我国已经登记的生物源农药的有效成分有115个，产品有3 764个，分别约占整个农药登记的17%和9.9%。其中，已登记的微生物农药有效成分就有42个，产品495个，主要涉及细菌、真菌、病毒、原生动物等不同类别，产品数量较多的品种主要包括苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌、木霉菌、白僵菌、绿僵菌、棉铃虫核型多角体病毒等[3]。目前，微生物农药的推广使用在农业生产的病虫害防治上已经略显成效。

黏质沙雷氏菌Serratia marcescens又称灵杆菌，是一种常见革兰氏阴性菌，其在生长过程中产生的次生代谢产物——灵菌红素在植物的病虫害防治方面发挥了重要作用[4]。在害虫生物防治上，黏质沙雷氏菌是一种重要的昆虫病原细菌，傅慧静[5]研究了黏质沙雷氏菌的木质素降解功能以及与寄主松墨天牛Monochamus alternatus Hope的协同关系;牛洪涛等[6]报道了黏质沙雷氏菌SJS1可以降低灰飞虱Laodelphax striatellus对杀虫剂的抵抗能力;傅仁杰等[7]研究发现黏质沙雷氏菌SM1菌株能够对林木害虫白蚁起到毒杀作用。在植物病害防治方面，黏质沙雷氏菌对多种病害有明显的抑制作用，李鹏鹏[8]发现黏质沙雷氏菌FS14对植物病害真菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum和核盘菌Sclerotinia sclerotiorum等有很强的拮抗作用;白腾飞等[9]发现黏质沙雷氏菌 YD25菌株对尖孢镰刀菌、小麦根腐病菌Bipolaris sorokiniana、西瓜腐烂病菌Colletotrichum lagenarium、辣椒炭疽病菌Colletotrichum capsici、立枯丝核菌Rhizoctonia solani等具有较好的抑制作用;黏质沙雷氏菌CFFSURB2 的次生代谢产物灵菌红素及几丁质酶可以抑制球腔菌Mycosphaerella孢子的萌发以及菌管的形成[10]。还有少量文献报道黏质沙雷氏菌能够抑制植物生长，黏质沙雷氏菌Ha1菌株的代谢产物粗提物对马唐Digitaria sanguinalis有一定的抑制作用[11]，部分黏质沙雷氏菌及S.proteamaculan菌株能引起植物超敏反应[12]，其次生代谢产物灵菌红素也具备一定的除藻活性[1314]。

本试验在室内条件下测定了黏质沙雷氏菌Ha1菌株发酵液和活体颗粒剂对6种玉米田常见杂草的除草活性，以期为今后筛选除草活性物质和开发新型微生物农药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：黏质沙雷氏菌Ha1菌株，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供。

供试杂草：马唐Digitaria sanguinalis、虎尾草Chloris virgata、反枝苋Amaranthus retroflexus、稗草Echinochloa crusgalli、苘麻Abutilon theophrasti、牵牛Ipomoea nil，以上杂草种子均于2017年9月在保定市南堤路采集。

固体LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂粉15 g，氯化钠5 g，蒸馏水定容至1 000 mL，用NaOH将pH调至7～7.5。

发酵液培养基：不添加琼脂粉的液体LB培养基。

试验药剂：蛋白胨，北京双旋微生物培养基制品厂;酵母膏，北京太阳生物科技有限公司;高岭土，保定化轻公司;粗面粉，保定江城面粉厂。

试验仪器：高温湿热灭菌锅，北方华粤贸易有限公司;恒温恒湿培养箱，宁波东南仪器有限公司;恒温振荡器，湿法制粒机，北京开创同和科技发展有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

将保存在-80℃冰箱中的黏质沙雷氏菌Ha1菌株的冻干菌粉接种到固体LB培养基上，放入温度为28℃，湿度为24%的恒温恒湿箱中培养48 h，待长出单菌落后备用。

1.2.2 菌悬液和发酵液的制备

用接种针挑取固体培养基上的 Ha1 菌株单菌落接入100 mL灭菌的液体LB培养基中，在温度为30℃，转速为160 r/min的恒温振荡培养箱培养48 h，作为菌悬液。

取1 mL培养48 h的菌悬液放入150 mL灭菌的液体LB培养基中，在温度为30℃，转速为160 r/min的恒温振荡培养箱中培养72 h，作为发酵液。

1.2.3 发酵菌数的测定

平板计数法：取0.1 mL待测菌液涂布于固体LB培养基上，培养36 h后，测定单菌落数目。

1.2.4 颗粒剂的制备

将Ha1发酵液用无菌水进行梯度稀释（10-1～10-8），之后分别吸取0.1 mL不同浓度的发酵液均匀涂布在固体LB培养基上，置于培养箱中培养，观察并记录菌落生长情况，找出制作颗粒剂最适的发酵液浓度，即1010 cfu/mL。将粗面粉和高岭土置于171℃高温干热灭菌3 h，待其冷却后，取400 g粗面粉，200 g高岭土放入白瓷盘内充分混匀，再向内缓慢加入400 mL培养了24 h，含1010 cfu/mL的黏质沙雷氏菌发酵液，充分混合制成生面团。将制作好的生面团放入湿法制粒机中，挤压制造成颗粒剂，自然晾干后装入自封袋中，在4℃条件下保存备用。

1.2.5 供试杂草的培养

将颗粒饱满、无损伤的马唐、反枝苋、稗草、虎尾草、牵牛、苘麻种子进行催芽。各取30～50粒上述杂草种子置于培养皿中，加入适量的1.5%次氯酸鈉消毒7 min，倒掉次氯酸钠，用灭菌的蒸馏水冲洗3次，最后将消毒的杂草种子放入铺有灭菌滤纸片的培养皿中，加入适量清水浸没种子，置于光照培养箱中，待种子发芽后备用。在长×宽×高为7 cm×7 cm×8 cm的小花盆中放入30 g左右的蛭石，将盛有蛭石的小花盆放到长×宽×高为32 cm×45 cm×15 cm的塑料盒中，在塑料盒中加入约3 L自来水，待小花盆中的蛭石浸湿后用镊子点种杂草种子，每个小花盆中均匀埋入10粒出芽整齐的种子，深度约为1 cm。将塑料盒用保鲜膜封口，置于恒温恒湿培养箱中培养，培养条件为温度25℃，光周期L∥D=12 h∥12 h，相对湿度75%。

1.2.6 Ha1菌株发酵液的除草活性测定

将发酵72 h的黏质沙雷氏菌菌液进行121℃灭菌和不灭菌两种处理。取2 mL不同处理的菌液均匀地喷洒到2～3叶期的马唐、稗草、反枝苋、虎尾草、苘麻和牵牛的茎和叶片上，设置清水处理作为空白对照，每个处理设4组重复。7 d后观察杂草茎和叶片的受害症状并测量鲜重，根据以下公式计算鲜重防效。

鲜重防效=（对照组鲜重-处理组鲜重）对照组鲜重×100%。

1.2.7 Ha1菌株活体颗粒剂的除草活性测定

颗粒剂填埋法：将制备好的颗粒剂与灭菌蛭石按照体积比6∶10的比例搅拌均匀，每个小花盆内装入48 g颗粒剂与蛭石的混合物，即每个小花盆内含有18 g颗粒剂和30 g灭菌蛭石，然后放入塑料盒中，加入3 L自来水，待蛭石充分浸湿后，每个小花盆内均匀点种10粒已发芽的杂草种子。每个处理设4次重复，设置无活体颗粒剂的蛭石种植杂草作为空白对照，待空白对照杂草生长至2～3叶期后测量鲜重防效。

颗粒剂撒施法：在每一颗杂草种子周围撒施0.05 g颗粒剂，每个处理设4次重复，设置无活体颗粒剂蛭石种植的杂草作为空白对照。待空白对照杂草生长至2～3叶期时测量鲜重防效，鲜重防效计算公式同1.2.6。

1.2.8 数据分析

采用 Microsoft Excel 软件和DPS软件进行数据整理和差异显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 Ha1菌株发酵液的除草活性测定

Ha1菌株发酵液茎叶喷雾处理的杂草3～5 d后出现萎蔫失绿和干枯等症状。未灭菌处理与灭菌处理的黏质沙雷氏菌Ha1菌株发酵液对供试的6种玉米田常见杂草的平均防效分别为47.88%和47.42%，差异并不显著（表1）。未灭菌处理的Ha1菌株发酵液对反枝苋、马唐、苘麻的防效分别为75.55%、62.10%、52.67%;灭菌处理的Ha1菌株发酵液对反枝苋、马唐、苘麻的防效分别为68.36%、50.18%、55.72%。对Ha1菌株发酵液对杂草鲜重的防效进行方差分析得出（表2），未灭菌和灭菌两种处理组间，处理组内亚组间差异显著水平均大于0.05，说明本试验处理组间以及处理组内各亚组间差异均不显著。本试验测定的6种玉米田常见杂草对黏质沙雷氏菌Ha1菌株发酵液的敏感性依次为：反枝苋、马唐、苘麻、牵牛、稗草和虎尾草。