不同真菌和植物种类对苜蓿滑刃线虫繁殖的影响

王珍 李冉 李红梅 范钧星 王暄

摘要 ：为探究美国进境苜蓿滑刃线虫对真菌的取食特性以及对植物的寄生性，通过接种试验观察该线虫在链格孢、灰葡萄孢、禾谷鐮刀菌、拟盘多毛孢和核盘菌等5种真菌，以及在菊花、大豆、苜蓿和三叶草等4种植物8个品种上的繁殖情况。结果表明，苜蓿滑刃线虫能取食5种真菌的菌丝体，但是在各真菌上的繁殖系数（Rf）有明显差异，在链格孢和拟盘多毛孢上能快速繁殖且数量很高，在灰葡萄孢上繁殖速度稍慢，但存活时间较长。接种苜蓿滑刃线虫后，大豆品种新叶出现轻微畸形或褐色病斑，苜蓿品种新叶出现畸形萎缩，而菊花和三叶草叶片没有症状;该线虫在各植物上的Rf值均低于1，表明这些植物不是合适的寄主。研究结果可为我国口岸实施外来植物线虫的检疫措施提供参考。

关键词 ：苜蓿滑刃线虫; 真菌; 植物; 繁殖系数; 寄生性

中图分类号：

S 432.45文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019546

Effects of different fungi and plant species on reproduction of Aphelenchoides medicagus

WANG Zhen1， LI Ran1， LI Hongmei1*， FAN Junxing1，2， WANG Xuan1

（1. College of Plant Protection， Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests， Ministry of

Education， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China; 2. College of Agronomy， Xinjiang Agricultural

University， Key Laboratory of Pest Monitoring and Safety Control on Crop and Forest， Urumqi 830052， China）

Abstract ：In order to explore the characteristics of Aphelenchoides medicagus intercepted from the USA in terms of fungal feeding and plant parasitism， the inoculation tests were carried out to evaluate the reproduction of nematodes on five fungal species， including Alternaria sp.， Botrytis cinerea， Fusarium graminearum， Pestalotiopsis sp. and Sclerotinia sclerotiorum， and on eight varieties of four plant species， including Chrysanthemum×morifolium， Glycine max， Medicago sativa and Trifolium repens. The results showed that A.medicagus could feed on the mycelia of five fungi， but the reproduction rates （Rf） of the nematodes on different fungi were significantly different. The nematodes could reproduce rapidly on the mycelia of Alternaria sp. and Pestalotiopsis sp. with high numbers， and relatively slower on the mycelia of Botrytis cinerea with high longevity. After inoculation with A.medicagus， the young leaves of soybean varieties exhibited slightly deformity or brown lesion spot， and the young leaves of alfalfa varieties showed malformation and shrink， while no symptoms were observed on the leaves of chrysanthemum and clover. The Rf values of nematodes on inoculated plant species and varieties were less than 1， which indicated that these plants were not suitable hosts. The results provided the useful information for Chinese ports to implement the quarantine measures for the exotic plant nematodes.

Key words ：Aphelenchoides medicagus; fungi; plants; reproduction rate; parasitism

滑刃线虫属Aphelenchoides Fisher种类众多，迄今该属的有效种约有180个[1]。该属大多数种为食真菌线虫，已报道寄生植物的种有13个[2]，其中，能够引起植物严重病害的种有贝西滑刃线虫A.besseyi Christie，1942、草莓滑刃线虫A.fragariae Ritzema（Bos，1890）Christie，1932和菊花滑刃线虫A.ritzemabosi（Schwartz，1911）Steiner & Buhrer，1932这3个种，典型寄主分别为水稻、草莓和菊花等[3]。这3个种为植物迁移性内寄生或外寄生线虫，寄主范围广泛，涉及种子植物门的98个科和蕨类植物门的25个科[2]，常为害植物的叶片、幼芽和茎秆，有时还可为害球茎、假根等，造成植物叶片皱缩、产生病斑和萎缩[3]，对多种观赏植物或农作物的产量和品质造成严重影响，被联合国农业和粮食组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和国际植物保护公约（International Plant Protection Convention，IPPC）列为检疫性有害生物[4]。世界各国都对检疫性有害生物高度重视，我国政府也制定了严格的检疫规程防止检疫性线虫在国际贸易中随植物材料传入。宁波海关在2017年1月对美国进境干苜蓿草Medicago sativa进行植物检疫常规检测时，从中截获一未知滑刃线虫属群体，我们通过形态学和分子生物学鉴定将其描述为苜蓿滑刃线虫A.medicagus Wang，Bert，Gu，Couvreur & Li，2019[5]。

为探究截获的美国苜蓿滑刃线虫取食真菌的特性以及是否具有植物寄生性，本文以5种真菌和4种植物8个品种为研究材料，通过接种试验观察苜蓿滑刃线虫在不同真菌和植物上的繁殖情况，以及在植物上产生的症状等，以期揭示苜蓿滑刃线虫的生物学特性，为我国口岸进境有害生物的植物检疫提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 线虫的繁殖和接种悬浮液制备

供试的苜蓿滑刃线虫群体用改良贝曼漏斗法[6]分离自美国进境苜蓿草，贝西滑刃线虫A.besseyi群体分离自安徽庐江水稻病粒。分别挑取各群体的单条雌虫至长满灰葡萄孢Botrytis cinerea不产孢突变菌株菌丝的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板（直径3.5 cm）上，置于25℃恒温箱中黑暗培养，待线虫长满平板后，获得两种线虫的纯化群体[7]。

将各纯化群体进一步接种在长满灰葡萄孢的PDA平板（直径9 cm）上进行扩繁[7]，待线虫长满平板后，用贝曼漏斗法分离PDA平板上的线虫并收集至10 mL离心管中，待线虫沉淀后，移去大部分上清液，加入等体积的4 000 μg/mL硫酸链霉素溶液进行线虫的表面消毒，充分混匀后静置4～8 h，移除上清液后，用无菌水清洗3～4次。将表面消毒后的线虫液定容至10 mL，摇匀后取200 μL均匀滴加多个小点于载玻片上，在体视显微镜下统计线虫的数量，重复5次取平均值，根据定容体积计算出线虫悬浮液的浓度，用于接种试验。

1.2 测定5种真菌对苜蓿滑刃线虫繁殖的影响

供试的5种真菌菌株分别是：链格孢菌一未知种Alternaria sp.（代码Asp），分离自与苜蓿滑刃线虫的来源相同批次的美国干苜蓿草样品;灰葡萄孢不产孢突变菌株（Bc）由南京农业大学植物线虫实验室保存;禾谷镰刀菌Fusarium graminearum（Fg）和核盘菌Sclerotinia sclerotiorum（Ss）由南京农业大学杀菌剂实验室馈赠;拟盘多毛孢菌一未知种Pestalotiopsis sp.（Psp）由宁波海关技术中心馈赠;参考方中达[8]的方法进行真菌的繁殖和接种，在无菌条件下，分别挑取各菌株的菌丝接种至直径9 cm的PDA平板上，将平板置于25℃恒温箱中黑暗培养7～10 d。待各真菌菌丝长满平板后，接种100 μL表面消毒的線虫悬浮液（浓度1 000 条/mL）至各平板中央，即接种量为100条/皿。每种真菌设27个平板重复，线虫接种第6天开始，每3 d取3个平板，观察线虫在真菌菌落上的繁殖情况并进行线虫的分离和计数，至接种后第30天为止。线虫分离和计数的方法同上。

1.3 测定4种植物对苜蓿滑刃线虫繁殖的影响

供试的4种植物8个品种分别为：菊花Chrysanthemum×morifolium，品种‘红太阳（代码CmSun）和‘如烟（CmSmog）幼苗，由南京农业大学园艺学院菊花研究团队馈赠;苜蓿Medicago sativa，品种加拿大‘3010（MsCAN）、法国‘三得利（MsFR）和中国‘甘农5号（MsCNG5）种子，由新疆农业大学农学院李克梅老师馈赠;大豆Glycine max，品种‘黑豆（GmB）和‘黄豆（GmY）以及三叶草Trifolium repens（Tr）种子购自市场。测定苜蓿滑刃线虫在这些植物上的繁殖情况，以贝西滑刃线虫接种作为阳性对照，以蒸馏水接种为阴性对照。各接种处理设4个重复。试验独立重复2次。

用于种植的塑料杯规格为直径7 cm×高10 cm，盛有灭菌土（沙壤比1∶3）。菊花幼苗在塑料杯中定植2周后，参考徐建华等[9]的方法接种线虫于植株新芽部位，接种量为3 000 条/株。‘黑豆和‘黄豆种子经25℃催芽2 d后，播种于塑料杯中，待幼苗长至4叶期，参考Meyer等[10]的方法接种线虫于植株新芽部位，接种量为400 条/株。苜蓿和三叶草种子播种于塑料钵中，待苗长至4叶期进行间苗，选取长势一致的健壮苗，参考Wang等[11]的方法接种线虫于苗的生长点，接种量为400 条/株。

接种线虫后，用保鲜袋包裹住有脱脂棉的植株接种部位，保湿48 h后去除保鲜袋和脱脂棉，将植株置于25℃温室中培养，定期浇营养液。每隔3～5 d观察各处理植株的生长情况以及叶、茎部位的症状表现等。30 d后，将各植株地上部的茎和叶组织分别剪成长约5 mm的碎块，分别装入10 mL离心管中，加入蒸馏水浸泡24 h后，用蒸馏水冲洗组织碎块1～2次，收集液体至计数皿，随机挑取数条线虫制成临时玻片，在光学显微镜下检查确认线虫种类后，在体视显微镜下对皿中线虫进行计数。

1.4 数据分析

根据不同真菌菌株处理以及不同植物处理所分离到的线虫总数，计算繁殖系数（reproduction rate，Rf），即分离所得线虫总量与初始接种线虫量的比值。用Microsoft Excel 2016计算繁殖系数的平均值和标准误（SE），用软件DPS进行数据分析，利用Duncan氏新复极差法在P=0.05水平上进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 苜蓿滑刃线虫对5种真菌菌丝体的取食特性

将苜蓿滑刃线虫接种5种真菌菌落平板后，观察线虫取食菌丝体的情况，接种后第9天链格孢（Asp）、灰葡萄孢（Bc）、拟盘多毛孢（Psp）和核盘菌（Ss）菌落中央均呈现明显的线虫取食圈，菌落中央凹陷（图1），第12～15天，线虫取食圈持续扩大，15 d时平板上的气生菌丝完全消失，而禾谷镰刀菌（Fg）菌落在第12天才出现明显的线虫取食圈，30 d 时平板上菌落边缘仍然可见气生菌丝。

从图1中可以看出，链格孢的灰白色菌落被线虫取食殆尽后，平板呈灰黑色;灰葡萄孢突变菌株只产白色气生菌丝，菌丝被线虫取食完后平板呈浅灰色;禾谷镰刀菌的淡粉色气生菌丝被线虫取食后，平板呈粉红色;拟盘多毛孢白色气生菌丝被线虫取食殆尽后，平板呈浅灰色并且有大量的子实体黑色小颗粒;核盘菌白色气生菌丝被全部取食完后，平板呈浅灰色并且有大量的黑色菌核，表明苜蓿滑刃线虫主要取食这些真菌的气生菌丝和分生孢子，不取食它们产生的子实体和菌核等。

2.2 5种真菌菌落上苜蓿滑刃线虫的繁殖量比较

在5种真菌菌株平板上接种苜蓿滑刃线虫后，统计线虫的繁殖系数（Rf），从繁殖系数动态可以看出（表1），接种第15天时，线虫在链格孢（Asp）和拟盘多毛孢（Psp）上的繁殖数量达到最高峰，Rf值均超过1 000，与灰葡萄孢菌（Bc）、禾谷镰刀菌（Fg）和核盘菌（Ss） 3个处理的Rf值有显著差异（P<0.05）。灰葡萄孢处理的Rf值在接种第27天时达到最高，为929，与其他真菌处理有显著差异（P<0.05）;核盘菌处理的Rf值在接种第24天时达到最高，为203，禾谷镰刀菌处理的Rf值在接种第27天时达到最高，为92.7，这两种真菌处理的Rf值均显著低于其他3个真菌处理（P<0.05）。接种第30天时，灰葡萄孢和拟盘多毛孢处理的Rf值均显著高于其他3个真菌处理，表明苜蓿滑刃线虫在这2种真菌平板上不仅能大量繁殖，且能够以高群体密度存活较长时间。

2.3 不同植物上线虫产生的症状观察

将苜蓿滑刃线虫和作为对照的贝西滑刃线虫接种供试植物后，观察30 d内线虫产生的症状。贝西滑刃线虫接种后第6天，

菊花品种‘红太阳呈现心叶干枯褐色坏死，

菊花品种‘如烟的新叶呈现明显皱缩、发育不良，随后干枯坏死，

‘黑豆和‘黄豆的接种叶片叶脉上均出现黄色至褐色病斑，3个苜蓿品种‘三得利‘3010和‘甘农5号的新生叶片均出现明显的皱缩和畸形症状，而三叶草在接种9 d后出现新生叶片发育不良、畸形和皱缩的症状。苜蓿滑刃线虫接种后第6天，‘黑豆新叶末端边缘产生轻微的畸形，没有出现病斑，‘黄豆叶片出现细小的褐色病斑，但叶片没有畸形;3个苜蓿品种的叶片畸形，不能正常展开，茎秆发育不良;而菊花品种‘红太阳和‘如烟以及三叶草接种新叶均未出现明显症状，与对照植株没有差异。接种后第30天，所有供试植物的症状只局限在接种部位新叶上，其他部位没有出现症状（图2）。

2.4 不同植物上线虫的繁殖量比较

在供试植物上接种苜蓿滑刃线虫和贝西滑刃线虫30 d后，分离植株地上部茎叶组织中的线虫，镜检观察发现线虫主要分布在植株的接种部位附近组织，其他部位组织中没有分离到线虫。对分离的线虫数量进行统计并计算繁殖系数（Rf），结果显示（表2），接种苜蓿滑刃线虫后，苜蓿品种‘3010處理的线虫Rf值最高，为0.272，与其他植物处理的Rf值呈现显著差异（P<0.05），但是苜蓿滑刃线虫在所有供试植物上的Rf值均低于1，表明这些植物不适合苜蓿滑刃线虫的正常繁殖。接种贝西滑刃线虫后，苜蓿品种‘三得利处理的线虫Rf值最高，为0.139，而菊花品种‘如烟处理的线虫Rf值最低，这两个处理的Rf值之间差异显著（P<0.05）。

3 讨论

滑刃属线虫可取食多种真菌，贝西滑刃线虫Aphelenchoides besseyi[12]、蘑菇滑刃线虫A.composticola[13]均可在链格孢Alternaria alternata上正常生长繁殖。本文将苜蓿滑刃线虫接种至5种真菌上，发现线虫可取食所有供试真菌的菌丝体，但是取食速度和繁殖数量不同，取食链格孢（Asp）和拟盘多毛孢（Psp）速度最快，且繁殖数量最多，培养15 d繁殖系数达1 000以上，推测苜蓿滑刃线虫对这两种真菌的偏好性较强。滑刃属线虫用口针刺穿真菌细胞壁后取食营养，不同种类的真菌其细胞壁化学组分和厚度存在差异，对线虫的取食效率可能会产生影响，从而造成线虫在不同真菌上的繁殖数量存在明显差异[14]。滑刃属线虫可在镰刀菌属Fusarium多种真菌上繁殖生长，贝西滑刃线虫在串珠镰刀菌F.moniliforme、茄镰刀菌F.solani和木贼镰刀菌F.equiseti [12]上均可正常生长繁殖，蘑菇滑刃线虫在尖孢镰刀菌F.oxysporum[13]，以及双尾滑刃线虫A.bicaudatus在厚垣镰刀菌F.chlamydosporum[14]上均可正常生长繁殖，但这些线虫在不同种类真菌上的繁殖系数均存在显著差异。此外，真菌产生的次生代谢产物也会影响线虫的生理活动，阻碍线虫活动或卵的孵化，严重时直接造成线虫死亡，影响线虫群体在真菌上的繁殖[15]。禾谷镰刀菌F.graminearum可产生脱氧雪腐镰孢菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等真菌毒素，对真核生物有一定毒性，可引起人畜的急慢性中毒[16]，而本研究的苜蓿滑刃线虫是真核生物，推测禾谷镰刀菌产生的毒素对该线虫的生长和繁殖有影响，从而导致在禾谷镰刀菌上的繁殖数量显著低于其他真菌。

柯赫氏法则（Kochs postulates）是大多数侵染性病害诊断的基本准则，对新病害病原物的确定更为重要。Meyer等[10]通过柯赫氏法则证实贝西滑刃线虫A.besseyi是引起巴西大豆“Soja Louca II”病的病原物，发病植株呈现茎叶畸形和萎缩，花芽无法正常分化，豆荚发育受阻和产生棕色坏死斑等症状。本文中，分离自水稻的贝西滑刃线虫接种后在两个大豆品种‘黑豆和‘黄豆植株叶片的叶脉部位产生了轻微的黄色至褐色病斑，线虫的繁殖系数均低于1，表明与引起巴西大豆“Soja Louca II”病的贝西滑刃线虫相比有明显的致病力差异。Oliveria等[17]将分离自草莓的贝西滑刃线虫群体接种草莓、非洲菊、大豆和苜蓿后，在草莓和非洲菊植株叶片上产生明显的皱缩或畸形等症状，但在大豆和苜蓿上无明显症状出现;接种60 d后，在草莓上的繁殖虫量低于初始接种量，而在非洲菊上的繁殖虫量高于初始接种量，推测非洲菊是贝西滑刃线虫的又一新寄主，而两种植物叶片的结构差异可能是造成线虫数量分布不同的原因。苜蓿滑刃线虫分离自美国进境干苜蓿草，接种苜蓿3个品种后，接种部位均呈现叶片畸形萎缩和茎秆发育不良，但是线虫的繁殖系数均小于1，表明这3个苜蓿品种不是苜蓿滑刃线虫的合适寄主。然而，线虫群体的繁殖能力常因寄主不同或地理区域不同而存在差异[1820]，苜蓿滑刃线虫在加拿大品种的繁殖率显著高于法国和中国品种，推测来自北美的苜蓿品种可能更适于该线虫的繁殖。此外，苜蓿滑刃线虫接种两个大豆品种后，只在接种部位叶片上产生畸形或褐色病斑症状，且繁殖系数均低于1，推断大豆不是苜蓿滑刃线虫的合适寄主。苜蓿滑刃线虫是否具有植物寄生特性，还需要进一步对更多的植物种类进行接种测定。

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（責任编辑：田 喆）