远志皂苷对转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型行为学及寿命的影响

刘 莹，刘 莉，关慧波

（1.黑龙江中医药大学中西医结合临床博士后流动站，哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院心血管病一科，哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学基础医学院中医诊断教研室，哈尔滨 150040）

阿尔茨海默病（alzheimer disease,AD）是临床常见的一种痴呆类型，也称为“老年性痴呆”。其发病多见于老年人群，在我国60 岁以上阿尔茨海默病的发病率达7.2%。是一种以认知障碍、记忆力减退、行为异常等为主要临床表现的神经退行性疾病。在阿尔茨海默病发病的多种致病因素中，基因突变或表达异常是已确定的病因，至少有70%与其相关。老年斑和神经纤维缠结是阿尔茨海默病患者脑内相同的病理特点，Tau 蛋白是神经纤维缠结的结构蛋白，tau 蛋白和tau蛋白基因在阿尔茨海默病的发生发展中起到极为重要的作用。

远志为远志科多年生草本植物远志（Polygala tenuifoliaWill.）或宽叶远志（P.sibirica L.）的根，最早见于《神农本草经》。远志具有宁心安神功效，治疗心神不安、惊悸、失眠、健忘等证。《神农本草经》：“利九窍，益智慧，耳目聪明，不忘，强志，倍力”。《药性论》：“治健忘，安魂魄，令人不迷”[1]。有学者对远志做了大量的脑保护及记忆改善实验，结果均表明远志可以改善实验动物的记忆能力。远志皂苷是远志属植物中的主要药效成分[2]。研究显示，远志皂苷具有改善记忆能力，抑制脑组织的氧化应激[3]，脑保护[4]等作用。

本实验以转tau 基因果蝇为模型，通过果蝇攀爬能力实验、果蝇嗅觉记忆实验及果蝇寿命实验评价远志皂苷对阿尔茨海默病的治疗作用。

1 实验材料

野生型Canton special（CS）黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）（由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所果蝇资源与技术平台提供）；转tau 基因果蝇（印第安纳大学伯明顿果蝇储存中心）；远志皂苷（成都曼思特生物科技有限公司提供）。基础培养基的制备：玉米粉42 g，琼脂3 g，蔗糖31 g，酵母粉3 g，以上材料倒入460 mL 蒸馏水，不断搅拌并加热，煮沸后4 min，加入2.5 g 丙酸，持续搅拌，直至冷却。倒入高12 cm，直径3 cm 经高温灭菌的指管中，培养基厚度约2 cm。培养基需倒置于干燥实验室内24 h 以上。远志皂苷培养基的制备：在基础培养基中加入远志皂苷，制成2%浓度远志皂苷培养基（前期实验得出结论2%为实验最佳浓度）。

2 实验方法

2.1 收集处女蝇 12 h 内孵化出的幼虫不交配，在12 h内把雌雄果蝇分开培养，所得的果蝇即为处女蝇。每天晚上18:00－19:00 将培养瓶内的成蝇转移，次日早晨6:00－7:00 对新羽化的果蝇进行挑选，麻醉后收集12 h 内羽化的雄性处女蝇，将其移入装有新鲜培养基的玻璃指管内，每个玻璃指管30 只左右，并标明日龄。每3 d 更换1 次培养基。

2.2 分组方法 收集正常雄性CS 型处女蝇，喂基础培养基（空白组）；转tau 基因雄性处女蝇，喂基础培养基（模型组）；转tau 基因雄性处女蝇，喂2%浓度远志皂苷培养基（远志组）。连续喂养5 d（前期实验结论，5 d 为最佳给药天数），每2 d 更换1 次培养基。测试时每组果蝇各取40 只。

2.3 果蝇攀爬能力实验 果蝇攀爬能力实验是利用果蝇的反趋地性，通过观察果蝇在垂直的指管内的爬行情况来测试果蝇的运动能力。将3 组待测果蝇分别装入高×外径×厚为12 ×3 ×0.1 cm3空指管中，果蝇置空指管内适应5 min，轻晃指管将果蝇摇至瓶底，果蝇由于习性将向上爬（正常果蝇具有反趋地性行为，即在一个垂直地面的空间内会自发地向上运动）。暗室红灯下测试10 s 到达指管顶部的果蝇个数（A），至少连续记录5 次，每次至少间隔1 min，每次晃动的力度一致。计算攀附指数CI ＝A／总数。记录5 次攀爬指数取平均值。

2.4 果蝇嗅觉记忆实验 将3 组待测果蝇分别放入空指管内饥饿2 h 后，放入1 000 mL 的烧杯中。烧杯中放有2 个50 mL 带孔离心管，其中一个离心管内直接放入香蕉，果蝇可闻到气味，并且通过孔洞进入离心管内时可直接吃到香蕉；另一个在香蕉的外面包有两层纱布，果蝇可闻到气味，但无法吃到香蕉。每隔1 h记录进入无障碍离心管果蝇的数目，连续记录8 h，每组记录5 次，取平均值。

2.5 果蝇寿命实验 每天早8 时统计3 组果蝇的死亡数目，直到果蝇全部死亡。每组中所有果蝇存活天数的代数平均数为本组平均寿命；每组中前半数果蝇存活天数的平均值为半数死亡时间；每组中最后死亡的10 只果蝇存活天数的平均值为本组的最高寿命。

2.6 统计学方法 果蝇攀爬能力实验数据用均数±标准差（）表示，采用SPSS 19.0 进行χ2检验，果蝇嗅觉记忆及寿命实验数据采用均数±标准差（）表示，采用SPSS 19.0 进行t检验。

3 结果

3.1 远志皂苷对转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型攀附指数的影响 见表1。

表1 远志皂苷对转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型攀附指数的影响（）

表1 远志皂苷对转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型攀附指数的影响（）

注：与模型组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.2 远志皂苷对转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型嗅觉记忆的影响 见表2。

3.3 远志皂苷对转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型寿命的影响 见表3。

表2 远志皂苷对转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型嗅觉记忆的影响（）

表2 远志皂苷对转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型嗅觉记忆的影响（）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

表3 远志皂苷对转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型寿命的影响（）

表3 远志皂苷对转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型寿命的影响（）

注：与空白组比较，P ＜0.05；与模型组比较，# P ＜0.05

4 讨论

实验研究从抗氧化应激、抗炎、影响细胞周期等不同机制方面和调节不同通路方面证实远志皂苷对神经细胞起到保护作用。刘威等[5]研究表明远志皂苷能通过下调Caspase-3、Bax 表达、提高细胞膜稳定性来减轻新生大鼠神经细胞缺氧/复氧损伤，对其神经细胞起到保护作用。还有研究[6]证实，远志皂苷对NAPP/PS1 双转基因小鼠学习记忆能力有保护作用，机制同样与上调Bcl-2,下调Bax、Caspase-3 表达有关。远志皂苷对丙泊酚重复麻醉大鼠学习记忆能力有保护作用，与其降低氧化应激损伤及减少细胞凋亡有关[7]。李巧[8]研究结果显示，远志皂苷能抑制Aβ的神经毒性，提高细胞抗氧化能力，减轻炎性损伤，从而起到神经保护的作用，可能与其调节AMPK/m TOR/ULK1通路，上调Beclin-1,LC3-II/I 蛋白表达而活化自噬过程，降低BACE1 活性，使Aβ 减少有关。郭新明[9]研究结果显示，远志皂苷能改善快速老化小鼠学习记忆能力，其机制可能与降低脑组织乙酰胆碱酯酶水平相关。倪杰等[10]以阿尔茨海默病大鼠为研究对象，发现远志皂苷可以提高Aβ1-40 诱导的阿尔茨海默病大鼠的学习记忆能力，其机制可能与提高海马低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRPP1）含量有关。郑尧杰[11-12]对远志皂苷干预Aβ 诱导的PC12 细胞功能的研究结果显示，远志皂苷能抑制PC12 细胞周期活化进程，与降低细胞周期蛋白表达有关，并能提高Aβ 转运，减轻Aβ 导致的过度氧化应激对细胞的损伤等机制有关。

陈玉静等[13]研究表明，在体外培养的PC12 细胞，其tau 蛋白磷酸化在某些位点上受到O-Glc NAc 糖基化修饰的负调节，远志皂苷元能通过提高O-Glc NAc 糖基化表达，而降低 PC12 细胞tau 蛋白磷酸化水平。远志皂苷能减轻阿尔茨海默病大鼠脑神经元中tau 蛋白Ser396 位点过度磷酸化，减轻Aβ 造成的神经细胞毒，其作用机制可能与PKA 蛋白表达下调，PP2A 蛋白表达上调有关[14]。

在阿尔茨海默病患者脑中的tau 蛋白明显高于正常人，且表现为异常磷酸化、过度泛素化和糖基化[15]。Tau 蛋白是神经细胞骨架相关蛋白，参与神经细胞的骨架构成和功能。在阿尔茨海默病脑中，tau 蛋白异常磷酸化后失去了与微管蛋白的结合能力，不再参与稳定细胞骨架及促进微管组装功能的作用[16]。异常磷酸化的tau 蛋白损害细胞核和线粒体功能，减少轴突起始段的动作电位。病理tau 可以进一步包装成外体，由一个神经元释放，被另一个神经元摄取，促进其致病性[17]。干扰神经信号传导和神经物质转运，导致神经元营养障碍[18]，并聚集成双螺旋纤维丝（PHF），形成神经纤维缠结（NFTs）[19]，导致阿尔茨海默病的一系列认知和行为障碍表现。

果蝇在1901 年被用做实验对象，在生命科学发展的历史长河中，果蝇扮演了十分重要的角色。各类神经疾病的研究，如帕金森病、老年痴呆、衰老与长寿、学习与记忆、认知行为等等。以果蝇为实验模型的原因：在确定了的13 600 个果蝇基因中，有一半蛋白与哺乳动物序列同源。果蝇的染色体组小且全，给研究操作提供了方便[20]。与脊椎动物相比，果蝇的神经系统比较简单，所以对其解剖、生理、病理等方面的研究也就相对简单。果蝇与哺乳动物在神经疾病发生的蛋白质基础和信号通路，以及病证等方面都高度一致。且果蝇繁殖能力强，能够在短期内繁殖出试验所需数量。因此，研究神经系统基本问题，果蝇模型是非常简单、有效、易得的。转tau 基因果蝇的制备及鉴定方法：将表达tau 基因的质粒，用PCR 法扩增并构建到PUAST 表达载体中，用显微注射法在果蝇受精卵中注射构建好的重组分子，用mini-white 标记基因筛选，这种方法可以测出是否tau 基因整合到果蝇基因能够表达的区域内，可以得到独立的转tau 基因果蝇品系。当整合成功时，mini-white 在转基因果蝇体内编码蛋白使得其眼睛变成红色。

本实验结果显示：远志皂苷可显著提高转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型的攀附指数。远志皂苷显著提高转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型进入无障碍离心管的数量。远志皂苷显著提高转tau 基因果蝇阿尔茨海默病模型的半数死亡时间、平均寿命、最高寿命。以上实验所得出的结论，远志皂苷可有效提高转tau基因果蝇的运动能力、记忆力，延长其寿命。