不同海拔条件下丁香叶片角质层蜡质变化分析

武雄雄，冷迎慧，刘星杉，王振辉，邓国书，徐明行，段瑞君*

(1.青海大学生态环境工程学院，青海 西宁 810016；2.青海省贵德县林业站，青海 贵德 811700；3.青海省乌兰县林业和草原站，青海 乌兰 817199；4.中国科学院华南植物园，广东 广州 510650)

丁香属于丁香属(SyringaLinn.)植物，是温带树种，中国北部和西南地区是该植物的自然分布中心，其中，物种多样性最丰富的地区在东北、华北、秦岭以北和西南横断山区[1]。青海省西宁市地处“地球第三极”青藏高原东北部，海拔2 200 m左右，属高原大陆性气候，气温低、降雨少且密集[2]，其寒冷干旱气候极适于丁香种植，因此，在1985年丁香被选为西宁市市花[3]。山东省济南市地处华北平原，海拔223 m左右，属温带季风气候，四季分明，是丁香的产区之一。

植物叶片角质层蜡质作为植物叶片与环境直接接触的最外层，对气候的变化十分敏感[4]。为适应不同的气候条件，植物叶片角质层蜡质进化出独特的结构特点和生理生态适应机制，以帮助植物在低温、干旱和高紫外线辐射等逆境环境以及极端环境下的生存[5]。黄玲等[6]研究证实小麦的抗旱节水性(水分利用效率)及产量与其角质层蜡质含量及表型有关。郭彦军等[7-8]用PEG渗透模拟干旱胁迫的方法对苜蓿在水分胁迫下叶表皮蜡质的变化进行分析，初步揭示了水分因子对苜蓿叶表皮蜡质的影响机制。宫慧芳[9]认为小麦和水稻通过增加叶片角质层蜡质含量，限制非气孔水分散失以适应干旱环境。崔琦[10]的研究表明，西瓜叶片角质层蜡质含量显著增加，蜡质晶体增多响应干旱胁迫。以上均是对植物改变叶片角质层蜡质的结构、组分和含量来应对生长环境多因子变化的研究，本文为探明不同海拔条件下丁香叶片角质层蜡质的变化，以高海拔地区(西宁)与低海拔地区(济南)的暴马丁香(Syringaamurensis)和紫丁香(Syringaoblata)为研究对象，对其叶片角质层蜡质的组分、含量和形态的变化进行研究，以期为丁香叶片角质层蜡质与海拔因子的相关性影响积累基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以高海拔地区(西宁)和低海拔地区(济南)具有代表性的暴马丁香和紫丁香为试验材料，2017年7月选择树高、胸径相同且生长发育比较接近的健康植株，选择植株上部第3片展开叶，剪取距中间叶脉0.1 cm处的叶片为样品。

表1采样地点自然条件

1.2 试验方法

(1)丁香叶片角质层蜡质的提取。从样品上剪取5片靠近主叶脉处的1cm×1cm叶片，用10 mL正己烷(色谱纯，北京天根生物技术有限公司)浸润30 s收集蜡质，氮吹后加入80 μl BSTFA(色谱纯，北京天根生物技术有限公司)100 ℃衍生20 min，再经氮吹后，溶于20 μl正己烷。

(2)丁香叶片角质层蜡质组分和含量分析。采用三重四极杆气相色谱—质谱联用仪(GC-MS TSQP 8000 EVO)测定丁香叶片角质层蜡质组分与含量，三次重复。离子源条件为E1源，离子源温度250 ℃，MS传输管温度290 ℃，进样口温度260 ℃，扫描方式为full scan，扫描范围50～650 M/Z。气相升温程序：初温80 ℃，保持1 min；每分钟15 ℃升温到260 ℃，保持10 min；每分钟5 ℃升温到290 ℃，保持20 min。基于FID峰值来定量蜡质，同时根据内部标准物(C16烷)浓度计算丁香叶片角质层蜡质组分含量(μg/cm2)。

(3)丁香叶片角质层蜡质形态观察。取样品叶脉中部的叶片，剪成长宽约0.5 cm的小片，将叶片黏在电镜样品台上，干燥后进行离子溅射镀金膜，镀金后的材料采用扫描电子显微镜(JSM-6610LV，日本电子公司)进行形态观察。

1.3 数据分析

采用SPSS 13.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同海拔地区暴马丁香和紫丁香叶片角质层蜡质组分比较

通过对暴马丁香和紫丁香叶片角质层蜡质组分进行GC-MS分析表明，不同海拔地区暴马丁香和紫丁香叶片角质层蜡质组分存在差异(表2)。暴马丁香叶片角质层蜡质中含有37种已知化学结构的化合物，其中22种烃类，包括20种烷烃(C11H24、C12H26、C13H28、C14H30、C15H32、C16H34、C17H36、C18H38、C19H40、C20H4、C21H44、C23H48、C24H50、C25H52、C26H54、C27H56、C28H58、C31H64、C34H70、C44H90)，烯烃(C35H70)和芳环烃(C16H18)各1种；11种醇类，其中脂肪醇有8种(C12H26O、C15H32O、C16H34O、C17H36O、C19H34O2、C19H36O、C20H42O、C37H76O)，3种脂环醇(C30H52O、C30H52O2、C30H50O6)，2种酯类(C17H32O2、C29H58O2)，2种酚类物质(C14H22O、C15H24O)。紫丁香的叶片角质层蜡质中含有21种已知化学结构的化合物，包含有10种烃类，其中烷烃8种(C11H24、C12H26、C16H34、C20H4、C23H48、C24H50、C28H58、C34H70)，烯烃(C35H70)和芳环烃(C16H18)各1种；8种醇类，其中脂肪醇有5种(C17H36O、C19H34O2、C19H36O、C20H42O、C37H76O)，脂环醇3种(C30H52O、C30H52O2、C30H50O6)；2种酯类，不饱和酯(C17H32O2)和饱和酯(C29H58O2)各1种，酚类物质只有1种(C15H24O)。因此，暴马丁香叶片角质层蜡质组分较紫丁香叶片角质层蜡质组分更为复杂。

表2丁香叶片角质层蜡质组分比较

表2(续)

表3为丁香叶片角质层蜡质的定性分析结果，从表中可以看出，丁香叶片角质层蜡质组分中烷烃所占比例最大，在西宁和济南的紫丁香、暴马丁香中其相对含量分别达到78.30%、82.59%、72.37%和80.92%，其余成分如酚、酯、醇和其他相对含量所占比例较小(0.37%～23.44%)；>20C烷烃占总烷烃的较大部分，在西宁和济南的紫丁香、暴马丁香中其相对含量分别为61.94%、57.38%、63.84%、58.83%。

表3丁香叶片角质层蜡质相对含量对比

2.2 不同海拔地区暴马丁香和紫丁香叶片角质层蜡质各组分含量比较

对不同海拔地区的暴马丁香和紫丁香叶片角质层蜡质含量进行定量分析比较，结果表明，随着海拔升高，暴马丁香叶片角质层蜡质总量、烷烃和酚类呈下降趋势，分别从11.30、9.36、0.18 μg/cm2减少到7.33、5.30、0.12 μg/cm2，而酯类和醇类呈增加趋势，分别从0.17、0.07 μg/cm2增加到0.18、0.13 μg/cm2；紫丁香叶片角质层蜡质总量、烷烃和酯类呈下降趋势，分别从12.6、10.4、0.26 μg/cm2减少到9.22、7.21、0.18 μg/cm2,酚类和醇类呈增加趋势，分别从0.10、0.15 μg/cm2增加到0.46、0.18 μg/cm2(图1)。

t检验分析发现，在95%置信区间上，高海拔地区(西宁)相对于低海拔地区(济南)，暴马丁香叶片角质层蜡质C25H52含量从0.54 μg/cm2显著减少到0.05 μg/cm2(P<0.05)，C44H90含量从0.26 μg/cm2显著增加到1.47 μg/cm2(P<0.05)。紫丁香叶片角质层蜡质醇类总含量(P<0.05)和酚类总含量显著增加(P<0.05)。

图1 丁香叶片角质层蜡质总量及各组分含量Fig.1 Total amount of wax in the cuticle of Syringa leaves and the amount of each component

2.3 不同海拔地区暴马丁香和紫丁香叶片角质层蜡质形态比较

由图2可知，随着海拔和气候条件的变化，暴马丁香和紫丁香叶片角质层蜡质的形态均发生明显变化。

图2 不同海拔地区丁香叶片角质层蜡质形态Fig.2 Morphology of wax in the cuticle of Syringa leaves at different altitudes

高海拔地区(西宁)的紫丁香叶片角质层蜡质晶体形状为较大的不规则颗粒状，多数堆叠在一起，密度较大，分布较均匀；低海拔地区(济南)的紫丁香叶片角质层蜡质晶体形状为小而细碎的不规则颗粒状，堆积晶体极少，分布稀疏不均，密度较小，。

高海拔地区(西宁)的暴马丁香叶片角质层蜡质晶体形状为较大的不规则块状，多数晶体单个分布，大小均匀；低海拔地区(济南)的暴马丁香叶片角质层蜡质晶体形状多为薄而细碎的颗粒状，少数为哑铃状、杆状，晶体形状较大的数量较少，分布稀疏不均且密度较小。

3 讨论与结论

(1)本试验研究结果表明，紫丁香和暴马丁香采用了不同的适应机制以适应高海拔的环境。紫丁香通过增加叶片角质层蜡质的酚类和醇类来适应高海拔地区寒冷干旱的环境，酚类从0.10 μg/cm2增加到0.46 μg/cm2，醇类从0.15 μg/cm2增加到0.18 μg/cm2，这与Guo等[11]在研究菊科植物改变其叶片角质层蜡质醇类的含量以适应不同海拔环境胁迫的结果一致。此外，高海拔对暴马丁香叶片角质层蜡质C25H52含量和C44H90含量产生了显著影响，C25H52含量从0.54 μg/cm2减少到0.05 μg/cm2，而C44H90含量从0.26 μg/cm2增加到1.47 μg/cm2，这证实了Dodd等[12]认为在低海拔和高海拔地区，烷烃链平均长度的增加可能是由于在低海拔地区的夏季高温和高海拔地区的冰冻导致生理干旱，从而使角质层渗透性最小化的适应性结果的结论。

(2)扫描电镜结果表明，随着海拔和气候条件的变化，紫丁香和暴马丁香叶片角质层蜡质的形态均发生明显的变化，叶片角质层蜡质晶体结构更加紧密甚至发生熔融，以扩大其叶表覆盖面积来适应强紫外线辐射及干旱的高海拔环境。高海拔地区(西宁)的紫丁香和暴马丁香叶片角质层蜡质晶体较大且分布均匀，低海拔地区(济南)的紫丁香和暴马丁香叶片角质层蜡质晶体较小且细碎，堆积晶体极少；同一海拔、气候区域的紫丁香和暴马丁香晶体形态密度较为相似，尤其在低海拔地区。这与郭彦军等[13]在研究苜蓿科植物时发现的植物通过改变表皮蜡质层的密集覆盖，严重阻碍植物内部水分的蒸发，从而适应高海拔寒冷干旱环境结果一致。