循环miRNA作为冠心病潜在生物标志物的研究进展

刘月娥 关秀茹

(哈尔滨医科大学附属第一医院检验科，黑龙江 哈尔滨 150001)

冠心病是世界上最常见的心血管疾病之一，是一种主要由动脉粥样硬化引起的慢性病，许多研究揭示了冠心病的发病机制，但冠心病的死亡人数仍在逐年增加[1]。医疗技术的不断进步也使得冠心病的诊断方法不断完善，但仍存在一定的局限性，因此冠心病的早期诊断和有效预防在整个医学界面临着重大的挑战[2-3]。近年来非侵入性生物标志物miRNA的发现为冠心病的预测和诊断提供了强有力的手段，从而有助于临床医生尽早为冠心病患者提供最佳的预防和治疗措施。

1 冠心病的概述

1.1 冠心病的定义

冠心病是一种主要由动脉粥样硬化引起的慢性炎症性疾病，是由于动脉粥样硬化斑块引起血管狭窄所致的心肌缺血，从而导致临床上的一系列症状[4]。临床上主要分为稳定型心绞痛(stable angina pectoris，SAP)和急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)，ACS主要包括不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris，UAP)、非ST段抬高心肌梗死(non-ST segment elevation myocardial infarction，NSTEMI)和ST段抬高心肌梗死(ST segment elevation myocardial infarction，STEMI)[5]。尽管医疗技术在不断地进步，但冠心病仍是发达国家和发展中国家的主要死亡原因，并给人类带来严重的社会经济负担[6]。

1.2 冠心病诊断方法的不足

冠状动脉造影(coronary angiography，CAG)是诊断冠心病的金标准，但操作方法有创、繁琐且成本昂贵，检测范围主要在疾病的末期，如多个血管受到影响或多处动脉狭窄，CAG很难进行[2]。此外，目前应用最广泛的诊断冠心病的传统生物标志物，如超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肌酸激酶MB(CK-MB)、脑钠肽(BNP)、高敏肌钙蛋白T/I(hs-TnT/hs-TnI)和白细胞计数等，它们不仅受到年龄、遗传背景、心脏相关疾病、药物和生活方式的混杂影响，且特异性不高，不能用于疾病的早期诊断，也不能预测冠心病的未来并发症[3]。

2 miRNA的概述

成熟miRNA是一种存在于所有真核生物中的由18～25个氨基酸组成的非编码短链RNA[7]。miRNA前体通过特定的核糖核酸酶将茎环和末端环依次切割形成成熟的miRNA。大多数物种的miRNA都具有高度精确的末端，因此miRNA可通过与靶mRNA的3’非翻译区(UTR)末端完全或部分互补结合，调节转录后基因表达，不仅可诱导mRNA切割和抑制mRNA翻译，且可通过去烯基化、去帽和核外消化机制促使mRNA降解，从而降低蛋白的表达[8]。在某些情况下，miRNA也可增强基因的转录或mRNA的翻译，从而提高蛋白质产物的水平[9]。

miRNA一直是备受关注的话题，已有研究表明miRNA在发育时间、细胞分化、胚胎发生、新陈代谢、器官发生和凋亡等许多生物学功能中发挥着重要的作用[10]，且它们的异常表达参与许多疾病的发生与发展，包括心血管疾病、代谢性疾病、癌症和病毒的感染等[11]。其中，循环miRNA在体液中具有许多优势，成为许多疾病很有前途的治疗和诊断工具，并有望成为潜在的生物标志物[12-13]。

3 循环miRNA作为潜在生物标志物的优点

循环miRNA作为生物标志物具有许多优点，与冠心病的传统生物标志物相比，循环miRNA不仅在体液中稳定存在，表达量在年龄、性别或采样时间之间的差异较小，且检测方法快速、简单、灵敏和经济[3，14]。此外，循环miRNA在大多数体液临床标本中表达丰富，比传统的生物标志物更早地被检测到，且具有较高的组织类型、疾病状态特异性和敏感性[1，12]。与确诊冠心病金标准的CAG相比，循环miRNA具有无创、方便和成本低廉的优点[2]。

4 循环miRNA作为冠心病潜在生物标志物的临床应用研究

4.1 冠心病的早期诊断

冠心病在早期一般无任何症状，很难被发现，但冠心病的预测和早期诊断可使临床医生对患者进行危险分层，以便选择和决定合适的治疗方案，从而减轻冠状动脉并发症的发生[15]。目前，已有多种研究表明循环miRNA可能是冠心病预测和早期诊断的新型生物标志物。

Kumar等[16]将受试者分为冠心病、动脉粥样硬化前正常冠状动脉(normal coronary artery，NCA)及健康受试者三组，结果显示循环miR-133b和miR-21在NCA、SAP和ACS患者血浆中的表达水平较健康受试者显著下调或上调，并随疾病的不断进展逐渐降低或增高。由于循环miR-133b和miR-21在动脉粥样硬化前状态即可发生显著变化，因此可能作为冠心病早期诊断的潜在生物标志物。也有研究发现无保护左主干病变(unprotected left main coronary artery disease，uLMCAD)患者血浆中高表达的miR-182-5p和低表达的miR-5187-5p都有可能在有创诊断性CAG前区分uLMCAD患者和非冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)对照组。因此，血浆miR-182-5p和miR-5187-5p有望成为uLMCAD患者早期诊断的合适生物标志物[17]。

更为重要的是，一些循环miRNA在冠心病早期与传统的标志物相比，能更早地诊断冠心病。Li等[18]发现，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者早期血浆中miR-22-5p和miR-150-3p的水平显著升高，表达高峰早于心脏肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)；相反，循环miR-132-5p在AMI早期维持在低水平。且受试者操作特性曲线分析显示这三种miRNA组合与任何单一miRNA相比，区分AMI与对照组的能力显著提高。Bialek等[19]的研究也证实该结论，他们的结果显示STEMI患者入院时，血浆miR-208a水平显著升高，3 h达到高峰，较心肌梗死传统的生物标志物cTnI和CK-MB出现得更早，达高峰的时间更早。

4.2 冠心病的鉴别诊断

循环miRNA可用来区分冠心病与非冠心病患者，Bukauskas等[20]发现在心肌梗死后的前24 h内，STEMI患者血清中低表达的miR-30d-5p、miR-146a-5p和miR-23a-3p对STEMI患者与健康对照者具有一定的区分能力[受试者操作特征曲线下面积(area under the curve，AUC)值分别为0.745、0.800和0.806]。类似的，血浆中上调的miR-126-5p、miR-20a-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-30e-5p和miR-93-5p以及下调的miR-3184-3p和miR-671-3p均可区分冠心病与NCA患者(AUC值均>0.700)[21]。Horvath等[22]也报道STEMI患者血浆中高表达的miR-151-3p和miR-331能显著区分STEMI患者和对照组，AUC值均>0.750，但这两种miRNA的组合并不能提高诊断性能。

由于单一的循环miRNA对冠心病诊断的特异性和敏感性较低，因此多种循环miRNA的组合被许多学者提出。Nariman-Saleh-Fam等[23]的研究结果显示外周血单核细胞中的miR-25、miR-21和PETN基因这三种指标组合起来与任何单一指标相比，区分冠心病与其他各组之间的能力提高5%～28%。Zhang等[24]发现，严重冠心病患者血浆中高表达的let-7i-5p、miR-26a-5p、miR-32-3p和miR-3149对诊断严重冠心病患者具有较高的特异性和敏感性，它们的AUC值分别为0.634、0.745、0.795和0.818，且这四个miRNA的组合与任何一个miRNA相比，显示出更好的诊断性能(AUC值为0.837)。此外，另一项研究也证实，高表达的循环miR-29a-3p、miR-574-3p和miR-574-5p对冠心病具有较高的诊断能力(AUC值分别为0.830、0.792和0.789)，且它们的组合将使诊断能力提高8%～13%[25]。因此，多种miRNA的组合将显著提高对冠心病的诊断性能，有望成为未来研究的新方向。

4.3 冠心病严重程度的评估

冠心病的严重程度与死亡率密切相关，因此冠心病严重程度的评估是至关重要的[26]。许多研究表明，冠心病经CAG后，常使用Gensini评分(Gensini score，GS)、SYNTAX评分(SYNTAX score，SS)及急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ(Acute Physiology And Chronic Health EvaluationⅡ，APACHEⅡ)评分评估冠心病的严重程度和复杂性，从而更好地预测经皮冠脉介入术(percutaneous coronary intervention，PCI)和冠状动脉旁路移植术的心血管风险和预后[20，27]。

Bukauskas等[20]研究表明，STEMI患者血清中miR-23a-3p的表达水平与APACHE评分呈负相关。Wang等[26]发现SS>32(高SS)组血浆miR-208b和miR-499水平明显高于SS≤22(低SS)组和22

4.4 作为冠心病预后的标志物

miRNA被认为是心血管疾病，特别是冠心病潜在的诊断性生物标志物。但很少有研究对未来心血管事件的风险分层进行分析。近年来有些研究表明一些循环miRNA可作为冠心病风险评估和预后的生物标志物[32]。

一方面，循环miRNA可能是冠心病风险评估的有价值的生物标志物。Bukauskas等[20]发现，STEMI患者血清中miR-23a-3p的下调与全球急性冠状动脉事件注册(GRACE)死亡率风险评分呈显著的负相关，但Kaplan-Meier生存曲线预测和Cox回归分析显示，miR-23a-3p可能只对STEMI患者提供有限的短期预后价值。同样的，Mayer等[33]通过对冠心病患者的前瞻性研究发现，在稳定的慢性冠状动脉疾病患者中，miR-19a的低表达与独立于其他传统心血管危险因素的死亡风险显著增加相关。此外，一项对冠心病患者进行的6年随访研究也证实，血清中较高的miR-423-3p水平可显著提高经典心血管危险因素对冠心病的预测能力[34]。

另一方面，循环miRNA可用来预测冠心病患者的主要心血管不良事件(major adverse cardiovascular events，MACEs)、死亡率、冠状动脉狭窄进展和再狭窄。He等[35]的研究表明，ACS患者血浆中miR-21的表达水平越高，斑块越不稳定，发生急性心血管事件的风险越高。Tang等[36]发现，在接受PCI的使用阿司匹林和氯吡格雷的双重抗血小板治疗的冠心病患者中，高血浆miR-142水平与MACEs的显著高风险相关。同样的，Kim等[37]的一项meta分析证实，循环miR-133a、miR-208b、miR-126、miR-197、miR-223和miR-122-5p的高表达与高死亡率相关，而循环miR-208b、miR-499-5p、miR-134、miR-328和miR-34a的高表达与MACEs有关。此外，有研究报道，经PCI并植入药物洗脱支架的冠心病患者血浆中let-7f、miR-19a、miR-210和miR-296的水平与快速血管造影狭窄进展(rapid angiographic stenotic progression，RASP)风险降低独立相关，而血浆中miR-19a、miR-126、miR-210和miR-378与再狭窄风险降低独立相关[38]。以上研究虽未进一步证实循环miRNA与冠心病患者MACEs、死亡率以及冠状动脉狭窄的因果关系，但现阶段依然可通过检测循环血中某些特定miRNA的水平，对冠心病患者进行早期预测。本文所选择的对冠心病有诊断及预后作用的各种循环miRNA的总结见表1。

5 总结及展望

循环miRNA在体液中具有稳定存在和表达丰富的优点，有望成为冠心病潜在的新型生物标志物，从而有助于冠心病患者的早期诊断、鉴别诊断、严重程度以及预后的评估，但在临床上的应用仍受到许多限制，因此对循环miRNA用于诊断的可行性有许多不确定性。首先大多数研究中的样本量较小，收集的样本处于疾病的不同阶段，导致同一种循环miRNA在冠心病中的升高或降低程度不一致，甚至有些miRNA在不同报告中呈相反的趋势。其次，检测循环miRNA的方法虽已很成熟，但循环miRNA的含量较低而检测不出的情况时有发生。此外，循环miRNA的提取、定量方法及使用的参照基因未统一，导致检测结果无可比性。所以，稳定的循环miRNA作为冠心病的潜在生物标志物虽具有很高的应用价值，但目前还不能用于临床，需扩大研究的样本量并优化检测方法，对循环miRNA的应用进行大规模的验证。

表1 从冠心病近期研究中选取的循环miRNA总结

续表miRNA 变化研究群体检测方法作用样本类型参考文献miR-155miR-223上调上调CHD(n=300)vscontrol(n=100)qRT-PCR严重程度评估血浆[30-31]miR-19a下调CAD(n=487)post-stroke(n=329)预后(风险评估)血浆[33]miR-423-3p上调CAD(n=69)vsHC(n=60)small RNA sequencingqRT-PCR预后(风险评估)血清PBMCECs[34]miR-21上调ACS(n=44)vscontrol(n=25)qRT-PCR预后(MACEs)血浆[35]miR-142上调CAD(n=1 345)NGSqRT-PCR预后(MACEs)血浆[36]miR-133amiR-208bmiR-126miR-197miR-223miR-122-5pmiR-499-5pmiR-134miR-328miR-34a上调上调上调上调上调上调上调上调上调上调CAD(n=3 112)qRT-PCR预后(死亡率、MACEs)血清血浆[37]miR-19alet-7fmiR-210miR-296下调下调下调下调RASP(n=113)vsnon-RASP(n=173)qRT-PCR预后(RASP)血浆[38]miR-19amiR-126miR-210miR-378下调下调下调不变retenosis(n=64)vsnon-retenosis(n=222)qRT-PCR预后(再狭窄)血浆[38]