耐冷菌的适冷分子机制及在污水处理中的应用

申秋华，王晓杰

(海军勤务学院 海防工程系军港勤务教研室，天津 300450)

1 引言

随着经济发展和人口增长，城市生活污水年排放量迅速增加，水环境中污染物排放数量及处理难度逐渐加大。这些污染物质大量排入天然水体，消耗水中的溶解氧，引起水质恶化。因此，研究如何高效地处理城市生活污水是当前函待解决的首要问题。生活污水处理技术存在物理法、化学法、生物法之分。凭借自身无二次污染、效果好、成本低廉等优势，生物技术成为污水处理的主要手段[1～3]。国内城市生活污水处理方面，以生物处理技术为主，其处理系统主要是依赖具有降解活性的中温菌，当这种菌处于20～25 ℃温度区间时，可释放较强生物活性与降解活性[4～6]。若环境温度在10 ℃以下，绝大多数中温菌代谢功能减弱，甚至失活而死亡。我国北方区域冬季温度低，各大城市全年中月气温均值低于10 ℃的月份达6个[7，8]。从环境温度来看，冬季的低温对以中温菌为主的污水处理设备造成剧烈的影响，很大程度地减弱了其对有机污染物的去除效果，使得出水难以达标排放。为提升低温环境下污水处理效率，目前工程中主要采用降低污泥的处理压力、对污水施以一定保温处理、提高污泥浓度等措施[9～11]。这些措施虽在一定程度上能提高污水处理效率，但是大大增加了投资和运行费用，并未能从根本上解决低温带来的不利影响。

污水处理工程实践表明，当温度降低至10℃左右时，活性污泥中的大多数中温菌的生长受到抑制，但是仍有少数的耐冷微生物可以存活下来，存活下来的耐冷菌能够正常的代谢生长，并在污水处理中起着重要的作用。因此，要解决低温生活污水达标排放问题，有效的方法是筛选出能高效降解生活污水中有机污染物的耐冷微生物。因此，从根本上根除低温污水处理不佳的难题，有效途径是从活性污泥中分离筛选具有较高降解活性的耐冷菌。

2 耐冷菌的分类

对于微生物分布与代谢活动，温度是发挥着主要作用的一个环境因素。基于耐低温能力的区别，可将微生物划分成下述三类：低温微生物、中温微生物和高温微生物[6，12]。低温微生物的种类很多，包括真细菌、蓝细菌、酵母菌以及一部分单细胞藻类。根据Morito的定义，将低温微生物分为嗜冷菌和耐冷菌两类。嗜冷菌的生长繁殖的温度可低于0 ℃，其最适宜的温度应在15 ℃以下，若温度超过20 ℃，其无法生长繁殖；耐冷菌可生长繁殖的温度为0～5 ℃，生长最适宜的温度大于15 ℃，当温度超过20 ℃时，其依然可生长繁殖[6]。

耐冷菌对于一定范围内的温度波动具有较强的忍受能力，就在地球上的分布而言，相比嗜冷菌，耐冷菌的分布更具广泛性，自常温环境至低温环境皆能够分离得到耐冷菌[13～17]。现已自诸多低温环境，诸如淡水、冷冻食物、海水、冰川与高山的土壤等，分离到了各种类型的耐冷菌[18,19]。

已发现的耐冷菌主要有细菌、古菌、酵母菌、真菌、霉菌及藻类等。其中，细菌的数量和种类最多，并且以革兰氏阳性菌占主导。从极地和海洋分离到的耐冷菌是优势菌群，一些代表性的耐冷菌，见表1。

表1 耐冷菌的主要种属

目前已发现的耐冷菌主要包括：鞘氨醇单胞菌属，假单胞菌属，生丝单胞菌属，微球菌属，动性球菌属，盐杆菌属，弧菌属，节杆菌属，假交替单胞菌属，嗜冷杆菌属和盐单胞菌属等[4，20]。

3 耐冷菌的耐冷机制

温度对于任何生物来说，都是一个非常重要的环境因子。耐冷菌在长期的生物进化过程中，已形成了适应低温环境的特殊细胞结构和酶代谢机制。耐冷菌在长期的进化过程中，细胞内的细胞器结构以及酶的种类与结构均有别于中温菌，形成了一套与低温相适应的适冷分子机制。随着基因分析技术的发展，其耐冷机制可以从细胞膜结构、低温酶、蛋白质合成以及冷休克蛋白等几方面解释。

3.1 细胞膜结构

细胞膜在细胞同外部环境开展生命活动方面发挥着关键作用。耐冷菌通过对细胞膜内脂类的构成进行调节，从而实现对膜结构与流动性的有效调节，使得细胞正常生理机能得以维持[8，21]。低温条件下细胞膜流动性和结构的变化，能够保证其正常发挥吸收营养物质和电子转移等功能。当处于低温环境时，耐冷菌细胞内的不饱和脂肪酸含量升高，进而是脂类熔化点下降，此结构的变化对细胞膜流动性的保持有利[22，23]。诸如，Canillac等把3株中温菌、Psychrotrophs与Psychiophiles的Arthrobacter菌株，分别培养在各自最适宜生长温度以下的环境中，获得以下结果：3株菌的细胞膜含不饱和脂肪酸量皆上升[22]。众多研究证实，导致不饱和脂肪酸水平改变的原因主要为，饱和酶的引入导致脂肪酸的链长以及甲基支链发生改变。革兰氏阴性菌通过改变脂肪酸饱和度和甲基链长度，而革兰氏阳性菌更多是改变甲基键的类型和数目，这些变化对于低温时维持细胞膜的流动性具有重要意义。

3.2 低温酶

耐冷菌通常不会以产生孢子等休眠体的形式来抵御低温时的“冷胁迫”，而是通过酶含量改变，对酶浓度以及酶种类进行调节，由此定量与定性地对低温所致影响进行补偿[19，22]。低温酶是耐冷菌能够长期在低温环境下生存尤为重要的一个因素，它能够使得酶促反应在低温条件下进行。研究证实，当处于低温时，耐冷菌的酶活力除了有所增强，其分泌能力也有所提升。虽然在低于最适生长温度的条件下，耐冷菌的代谢速率减慢，但其仍能表现出更高的生化活力和更高的酶产出量。众多研究结果显示，耐冷菌的最高酶产生量出现在温度远低于其最适宜生长温度的环境中。

低温酶分子通常具备较高柔性，当处于低温环境时会快速调整自身构象，其活性中心更易于接受与释放底物，由此确保催化反应的成功实施[22]。例如，Narinx等从南极海水中2株不同的枯草杆菌中分离出两种蛋白酶，与中温菌蛋白酶的多肽链相比，这两株低温枯草杆菌的蛋白酶多肽链稍长。研究证实，此两类酶含二硫桥结构，同时，此结构使酶分子内基团间相互作用下降，酶与溶剂分子间相互作用提高，低温酶由此可具备较高柔韧性，同底物结合几率更高[19，22，24]。但是，低温酶的热稳定性较低，随着环境温度升高，低温酶容易发生去折叠结构变化，使酶的活性中心失去活性，且低温酶发生错误折叠的几率更高[8,9]。

3.3 蛋白质合成

耐冷菌在低温环境中约10%～15%的细胞内蛋白质经是由调节机制合成。在影响细胞蛋白质合成方面，温度的作用机制是调控核糖体上蛋白质或某类特异mRNA的翻译速率[19，22，24，25]。高温菌、中温菌的蛋白质存在冷不稳定的特性，其活性与温度正向相关，而耐冷菌的蛋白质处于低温时结构完整性与催化活性却无明显变化，因此表现出非常高的催化能力[6，22]。实验证实，耐冷菌处于低温时，最不易发生体外蛋白质翻译错误。比如，Szer等发现，当条件相同时，在蛋白质合成错配率方面，适冷性的假单孢杆菌低于中温菌。可见，低温时耐冷菌拥有有效启动的特殊功能，高温菌与中温菌则无此特殊功能。

研究证实，在耐冷菌的核糖体内能够提取得到一类在0 ℃时具有翻译能力的蛋白质，此类蛋白能够使大肠杆菌的核糖低于0 ℃时翻译Poly U聚合酶[4，22，24，26]。对于低温环境，中温菌的核糖体缺乏适应性，同时低温还会导致其细胞膜受损，造成细胞溶解而死亡。故0℃低温条件时，众多中温菌皆无法合成蛋白质。

3.4 冷休克蛋白

冷休克蛋白也称为冷激蛋白，它是通过耐冷菌的自身调节机制产生。冷休克蛋白最初是在大肠杆菌中发现的，总共发现了9种冷休克蛋白，分别命名为CspA～CspI。它是一类由68～74个氨基酸构成的小分子蛋白质，在核酸结合区都包含有两个一致的保守RNA结合基序。冷休克蛋白对于微生物低温耐受至关重要，其与RNA结合改变其二级结构，从而影响DNA复制以及转录和翻译等冷适应调节过程。当受到冷刺激时，微生物可生成冷休克蛋白这种关键性应激蛋白，此蛋白在低温时对维持耐冷菌的生理活性起着十分重要的作用[8，22，27]。在环境温度出现快速、大幅度降低等波动的情况下，耐冷菌会产生一种适应温差的冷休克反应，细胞内瞬时大量诱导分泌高达几十倍的冷休克蛋白。例如，Fujii等研究发现，对大肠杆菌进行冷诱导反应，温度从37 ℃下降到10 ℃后，CspA的浓度在1～1.5 h就能够达到100 μmol/L，并随后诱导产生多种冷休克蛋白。此外，通过探究耐冷酵母Trichos-poronpullulans的冷休克反应，Julseth等发现，当生长温度从21 ℃下降至5 ℃时，此耐冷酵母12 h内即可诱导合成26类冷休克蛋白[10，22]。

细胞通过产生冷休克蛋白来应对外界温度的变化，产生蛋白数量与温度降低的剧烈程度成正比关系。实际上，中温菌、耐冷菌以及嗜热菌在低温刺激时都会产生冷休克蛋白，只是这种调节机制在耐冷菌细胞内体现的更加明显。例如，Ray在自南极分离出的耐冷菌细胞内发现，冷休克基因在高温和低温时都可以正常表达，只是当温度由高温降低至5 ℃以下低温时，CspA 表达量大大增加。

耐冷菌通过调控在细胞膜、酶分子、蛋白质层面上精细的构成与结构变化，使低温时自身正常代谢活动与繁殖能力得以维持。耐冷菌的此适冷性的生物特征，决定了自身可高效降解低温污水中所含的污染物。探究耐冷菌的冷适应机理，能够为此类菌广泛应用于污水处理方面予以提供坚实的理论支撑。

4 耐冷菌在污水处理中的应用与展望

在微生物筛选技术快速发展背景下，借助耐冷菌可高效降解低温污水内污染物的独特优势，可显著扩宽其在环境工程特别是污水处理方面的应用范围[8]。通过引入筛选低温环境下的耐冷菌的措施，来克服低温对污水处理厂所带来的不利影响。国内外对耐冷菌在污水处理领域的应用已经进行了大量的研究。目前，耐冷菌在降解污水中的氮和磷、石油烃类、氯酚类、脂肪类等物质领域已经取得了很好的效果。国外对耐冷菌的研究起步比较早，比如，早在1974年，Westlake和Atlas等就从极地环境中分离到了能够降解原油的耐冷菌株。我国对耐冷菌的筛选与研究工作开始于20世纪90年代初。目前，我国已经从多种低温环境中分离出了大量耐冷菌，并且在耐冷菌的分子鉴定与技术培养等方面取得了一定的研究成果。

在生活污水处理系统中，国内外学者主要是研究在寒冷气候条件下耐冷菌对氮、磷和COD污染物的去除情况。城市生活污水处理大多选择生物处理方法，环境温度对此处理系统的效率具有较大影响，在实际工程运行过程中，若生化池的污水温度在10 ℃以下时，大多存在微生物生长停滞以及降解活性下降的现象[13]。原因主要在于，低温时中温菌细胞内代谢生成的酶亲和底物分子能力大大下降，酶催化活性减弱，生理代谢能力也随之下降。通过投加具有高效降解活性的耐冷菌，可有效克服低温对生活污水处理所带来的不利影响[28]。例如，李亚选等[19]于冬季自我国东北区域某污水处理厂二沉池的活性污泥内，分离出对有机污染物具有高效降解作用的耐冷菌。通过实验研究发现，当污水温度在10 ℃以下时，耐冷菌成为活性污泥中的优势菌群。低温时，耐冷菌对COD去除率相比中温菌对COD去除率高出63.67%；中温时，两者对COD去除率相差在10%以下，由此可见，耐冷菌在我国寒冷地区生活污水处理方面具有良好的应用前景。另外有研究发现，采用耐冷性的复合菌群处理低温生活污水比单一菌具有更高的COD去除率。学者姜安玺等[29]于冬季的市政下水道的污泥内提取得到4类耐冷菌，同时针对单菌与混合菌开展了有机物降解的对比实验。实验结果表明混合菌的对COD去除率高达72%，明显高于各单菌的去除率，节约了工程投资成本，从而证明耐冷菌在寒冷地区生活污水治理领域具有广阔的应用前景。

污水所含氮与磷污染物是造成水体富营养化的关键因素之一，这两类物质的去除对我国污水处理与生态平衡的维持发挥着非常关键的作用。大量研究发现，低温会使细菌的生物活性和生长速率大大降低，使得氮和磷的去除变得更加困难。经研究，张雷等[30]发现，借助低温驯化培养技术与微生物固定化技术构建的耐冷硝化菌群，可实现污水60%的氨氮去除率。固定化微生物技术能够提高低温污水的脱氮效率，克服悬浮态微生物流失问题。唐双[31]从天然冷水体中筛选得到3株优势耐冷菌Pseudomonas koreensis YB1、Pseudomonas fragi YB2、Pseudomonas lundensis YB3。后续采用吸附法和包埋法对混合耐冷菌进行固定化处理，与游离的混合耐冷菌相比，固定化的混合耐冷菌比单一菌株明显提高了低温污水的处理效率，且利用新型聚氨酯固定化材料包埋混合菌株可使污水中 COD、NH3-N去除率超过90%，TP 去除率超过60%。

5 结语

耐冷菌及其相关代谢产物的研究以及它们在污水处理工程中的潜在价值逐渐引起人们的广泛关注，并成为新的研究热点。国内外从低温环境下筛选出的耐冷菌株在污水处理中的效果也非常显著，但离实际的污水工艺的应用还有一定差距。究其主要原因是目前对于耐冷菌的研究大多局限于一种或者少数几种菌株，而实际污水是一个复杂的环境体系，需要数量和种类较多的优势菌株共同起作用。总之，国内外学者对耐冷菌的研究和菌株开发上处在摸索阶段，也缺乏一定的研究深度。因此，研究利用这些在低温环境中已分离到的耐冷微生物降解污水中的各种有机污染物，这对污水治理工作起很重要的作用。