UPLC-MS/MS 法研究柚皮苷在不同年龄大鼠体内的组织分布

2021-03-10伊金月邢怀玉孙慧峰

现代中药研究与实践 2021年1期

张悦，董蕊，伊金月，邢怀玉，孙慧峰，张宁, *，雷霞*

(1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江佳木斯 154007）

柚皮苷全称为柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一种二氢黄酮类化合物。大量研究表明，柚皮苷具有抗肿瘤、镇静、镇痛、调节血糖等药理作用[1-6]。柚皮苷还能通过下调海马中乙酰基胆碱酯酶活性和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）信号传导途径来消除顺铂引起的认知缺陷和胆碱能功能障碍[7]。

临床实践表明，药物的疗效不仅与血液分布有关，与药物在各组织内的贮藏也密切相关，对药物的有效性与安全性具有重要意义[8]。实验室前期对柚皮苷在大鼠体内的药物动力学进行研究，结果显示柚皮苷具有较好的组织亲和性，给药后能较快向组织分布。本研究通过UPLC-MS/MS 方法，检测青年组、老年组SD 大鼠灌胃柚皮苷后在不同时间点、不同组织中的药物浓度，比较在不同年龄段组织分布的差异，为柚皮苷的深度开发及利用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 仪器

ACQUITYTM 型超高效液相色谱仪、Quattro Premier™ XE 型三重四级杆质谱仪（美国Waters 公司）；AL204 型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 材料

柚皮苷（纯度 ≥ 98%，批号：110722-201111）、槲皮素（纯度 ≥ 98%，批号：100081-201408）购自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯）购自美国 Dikama 公司；水为实验室自制超纯水（美国Milli-Q 纯水器）；其它试剂均为分析纯。

健康Sprague-Dawley（SD）大鼠110 只，雌性，体质量为210 ～ 250 g，55 只青年大鼠（8 月龄），55只老年大鼠（18 月龄），由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（黑）2013-004。实验流程均符合实验动物管理和保护的相关规定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-1%乙酸水（B）等度洗脱（52% A ∶48% B）；流速为0.3 mL/min；柱温为35 ℃；洗脱时间为6 min；进样量为5 μL。

2.2 质谱条件

Quattro Premier™ XE 型三重四级杆线性离子阱串联质谱仪连接ESI 电喷雾离子源，在正离子模式下进行多反应检测（MRM）扫描；毛细管电压：3.5 kV；离子源温度：120 ℃；去溶剂温度：300 ℃；接口处加热，全程通入氮气流速：600 L/h，氩气：2.61×10-3Mbar，扫描时间：0.2 s。被测成分及内标的监测离子对分别为柚皮苷（581.5 →273.2）、槲皮素（303.2 →153.1），被测物的锥孔电压（Cone）和碰撞电压（Collision）分别为20 V 和25 V。

2.3 溶液的配制

精密称取柚皮苷、槲皮素标准品适量，配成浓度为200 μg/mL 的储备液。4 ℃冷藏备用。

2.4 标准组织样品的制备

精密称取各空白组织样本约0.2 g，加入1 mL 生理盐水，匀浆，取组织液0.5 mL，加入不同质量浓度的柚皮苷对照品工作液20 μL，涡旋30 s，依次加入内标工作液20 μL 和2 mL 甲醇（0.1%乙酸），涡旋2 min，配制成一系列浓度范围内6 个浓度的对照品溶液，离心（4 ℃，12 000 r/min，10 min，下同），吸取上清液，40 ℃下用氮气吹干，用100 μL 甲醇复溶，涡旋，离心，取上清液，进样5 μL。其中以高、中、低质量浓度制备质量控制组织样品，均平行制备6份。

2.5 组织样品预处理

取各组织0.2 g，分别加入1 mL 的冰生理盐水匀浆。取0.5 mL 组织匀浆液，置5 mL 的离心管中，加入2 mL 甲醇（0.1%乙酸），20 μL 内标溶液，涡旋2 min，离心得上清液。40 ℃下用氮气吹干，用100 μL甲醇复溶，涡旋，离心，取上清液，进样5 μL。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性考察在实验条件下测得空白组织、空白组织加柚皮苷和内标及灌胃给药后大鼠组织样品（加内标）的色谱图（以肾组织样品为例），柚皮苷和槲皮素（内标）的保留时间分别为2.69、3.42 min，显示各色谱峰之间分离度良好，表明大鼠组织中内源性物质不干扰柚皮苷和内标的测定，本方法具有较高的专属性，见图1。

2.6.2 线性范围考察按照“2.4”项下得标准组织样品，“2.1”“2.2”项下条件，以组织中待测物浓度为横坐标（X），以待测物与内标的峰面积比为纵坐标（Y），用加权最小二乘法进行回归运算，标准曲线相关系数R2范围均大于0.999 0，线性范围内线性关系良好，见表1。

2.6.3 精密度和准确度分别取每个脏器的空白组织匀浆，根据“2.4”项下方法制备柚皮苷成分大鼠组织匀浆液低、中、高3 个浓度的质量控制样品，每一个浓度进行样本分析，并与标准曲线同时进行。根据当日标准曲线计算质量控制样品的浓度，获得方法的精密度RSD 和准确度范围相对误差RE。结果表明柚皮苷日内和日间精密度的RSD 均小于15%，RE为-7.62%～12.24%。提示该方法准确、可靠、重现性好，符合生物样品分析要求。

图1 肾组织UPLC-MS/MS 色谱图Fig. 1 UPLC-MS/MS chromatogram of kidney tissue

表1 不同组织样品中柚皮苷的含量测定标准曲线Tab. 1 Determination standard curve of naringin in different tissue samples

2.6.4 提取回收率与基质效应取大鼠空白组织匀浆液500 μL，根据“2.4”项下方法分别制备6 份低、中、高浓度的质量控制样品，并使用当天的标准曲线进行测定，进样，记录其与内标的峰面积比为A；取空白组织，按照组织样品处理方法制备，氮吹后分别加入相应量的质量控制样品，平行进行样本分析，记录其与内标的峰面积比为B ；用水代替空白组织，分别加入配制的低、中、高浓度的质量控制样品，按照标准曲线制备的方法进行处理，平行进行样本分析，记录其与内标的峰面积比为C。其中回收率= A/B×100%，基质效应 = B/C×100%。对柚皮苷线性范围内低、中、高浓度各组织匀浆液样品提取回收率进行了考察，平均回收率的RSD 值均小于15%，符合生物样品测定要求。

2.6.5 稳定性试验分别测定柚皮苷低、中、高3个浓度各组织匀浆液质量控制样品在室温下放置4 h后、放置于-20 ℃的冰箱内反复冻融3 次和放置于-20 ℃的冰箱内冷冻30 d 后样品的稳定性。结果表明在上述保存条件下，样品均能达到稳定性的要求。

2.7 组织分布的研究

大鼠青年组和老年组分别随机分成9 组，每组6 只。按100 mg/kg 体质量灌胃给予柚皮苷水溶液，分别在给药后0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0 h 立即处死，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、子宫、卵巢、小肠，用生理盐水溶液洗去血迹，用滤纸吸干水分。按“2.4”项下方法处理组织样品，按“2.1”“2.2”项下方法检测大鼠给药后各组织中柚皮苷的含量。

青年组和老年组大鼠口服柚皮苷溶液后，在所有组织中都有分布；在0.25 h和0.5 h时，与青年组比较，老年组柚皮苷在心、肝、脾、肺、肾、胃、卵巢、小肠组织中浓度显著低于其在青年组组织中浓度；给药1 h 时，柚皮苷在老年组心、肾、卵巢、小肠中浓度比青年组大鼠低；而胃、子宫中浓度比青年组大鼠高；2 h 时，卵巢中浓度比青年组大鼠高；4 h 时，心、脾、肾、胃、卵巢、小肠中浓度比青年组大鼠高；8 h 时，脾、肾、子宫、卵巢、小肠中浓度比青年组大鼠高；12 h 时，心、脑、子宫中浓度比青年组大鼠高，见表2。

2.8 统计学方法

采用SPSS23.0 软件进行数据分析，计量资料以均数 ± 标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本t 检验。以P ＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

表2 给药后柚皮苷在大鼠体内的分布情况（±s，n = 6，ng/g）Tab. 2 Distribution of naringin in rats after administration（±s，n = 6，ng/g）

时间/ h 心脏肝脏脾青年老年青年老年青年老年 0.25 41.58±4.51 26.11±3.45** 4 936.58±330.20 4 105.34±429.94** 1 627.19±124.00 1 173.72±78.59** 0.5 506.47±24.26 295.25±21.54** 7 268.61±395.05 6 631.27±745.39 3 468.22±262.72 2 870.39±152.06** 1.0 1 278.64±49.92 936.61±92.36** 9 269.96±646.05 8 443.94±1060.23 8 246.09±551.64 8 531.92±556.78 2.0 157.31±20.14 146.72±6.15 7 583.71±787.96 4 896.26±491.92** 6 830.49±585.66 6 710.72±510.26 4.0 42.76±9.33 62.38±3.84** 3 623.72±362.74 2 778.14±260.69** 4 189.27±416.24 5 130.46±667.68* 8.0 33.32±7.7 35.93±3.84 6 881.85±751.91 5 843.26±310.27* 231.92±74.54 1 536.87±167.26**12.0 9.89±3.96 18.92±2.41** 115.49±62.26 106.88±11.51 78.97±21.74 245.95±29.31 F 2 497.409 509.824 196.373 136.354 460.890 378.736 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001时间/ h 肺肾脑青年老年青年老年青年老年 0.25 3 858.95±9.89 3 591.54±220.05** 5 235.55±115.49 3 335.82±242.94** 314.34±78.97 269.49±12.82 0.5 6 138.87±598.91 6 269.49±374.61 7 820.16±565.82 4 285.43±368.39** 816.53±115.94 732.59±44.44 1.0 8 217.89±578.41 8 691.47±292.61 8 834.72±428.54 7 643.54±679.76** 631.63±107.61 505.19±134.83 2.0 7 721.50±389.00 4 379.33±248.58** 6 205.44±410.27 4 931.42±296.72** 532.41±65.51 434.02±17.2** 4.0 3 518.14±481.57 3 085.29±172.08 1 574.13±114.95 2 268.15±76.36** 414.84±47.41 346.20±20.99* 8.0 430.78±188.4 419.16±34.38 290.39±73.26 881.29±18.56** 269.11±37.58 192.69±8.18**12.0 129.26±45.53 134.68±11.09 15.25±3.07 169.61±4.41 29.82±12.21 69.49±3.23**F 399.643 1 063.667 788.693 365.264 71.173 94.746 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001时间/ h 胃子宫卵巢青年老年青年老年青年老年 0.25 1 744.17±129.26 1 356.43±64.55** 1 744.17±129.26 1 356.43±64.55** 4 216.83±29.82 1 573.65±127.98** 0.5 4 165.53±368.70 3 841.09±30.58 4 165.53±368.70 3 841.09±30.58 6 332.58±242.19 2 594.63±323.17** 1.0 7 751.82±713.88 16 889.96±857.44** 7 751.82±713.88 16 889.96±857.44** 8 030.13±565.49 4 226.86±268.24** 2.0 8 090.61±661.89 7 533.78±399.73 8 090.61±661.89 7 533.78±399.73 3 701.02±418.34 8 831.37±786.23** 4.0 3 094.10±276.92 3 552.56±121.85** 3 094.10±276.92 3 552.56±121.85** 2 268.39±358.19 7 630.55±968.77** 8.0 329.75±87.53 387.53±19.85 329.75±87.53 387.53±19.85 182.99±35.06 528.88±30.07**12.0 12.14±4.8 13.21±1.61 12.14±4.8 13.21±1.61 - 47.62±3.51 F 383.993 1 608.707 383.993 1 608.707 551.326 284.605 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

注：与青年组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；“-”：未检测到。

3 讨论

研究药物在机体组织中的分布特征是药代动力学的重要组成之一，通过了解药物在组织器官的分布情况，对于确定药物在靶点的浓度是否能够调节分子靶点，从而产生最佳的药效学反应至关重要[9]。

大鼠口服柚皮苷后，在0.25 h 时各组织中均能检测到，说明柚皮苷分布较迅速而且广泛。由组织分布结果可知，相对其它组织，柚皮苷更多地分布在肝脏中，提示柚皮苷可能主要在肝脏代谢。但在青年大鼠的心和脑中分布较少；在老年大鼠的胃、肠和卵巢中分布较多，卵巢作为性器官，与体内雌激素的分泌密切相关，且随着年龄的增加，体内雌激素的含量逐渐减少，为柚皮苷等黄酮化合物具有与雌激素的作用提供研究思路。值得注意的是，虽然柚皮苷在脑组织中含量较低，但有明显分布，提示柚皮苷能够透过血脑屏障，为解释其具有抗老年痴呆、保护神经元损伤等神经药理作用[10-11]提供了实验依据。各组织浓度在达峰值时，柚皮苷在老年组大鼠心脏、肝脏、脾、肺、肾、胃、子宫中比青年组浓度低，而达峰之后的时间里，心、脾、肾、胃等组织中柚皮苷的浓度，老年组比青年组浓度高。说明柚皮苷在老年组大鼠体内存留时间延长，可能存在药物蓄积趋势。这可能是因为年龄影响了机体内药物代谢酶、转运蛋白、内源性生物因子等的改变，具体原因有待进一步的研究。