赤水乌骨鸡不同产蛋期SPIA1基因的差异表达研究

罗韦，李辉*，陈林，叶涛，黄锡阳，司宗贵

(1. 贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2. 贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳 550025；3. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；4. 贵州竹香鸡养殖有限公司，贵州 赤水 564708)

赤水乌骨鸡是贵州省赤水市的地方家禽品种[1]。赤水乌骨鸡产绿壳蛋，蛋具有低胆固醇、低脂肪的特性，富含硒、铁、锌等多种微量元素[2]。早期遗传学研究发现，鸡蛋绿壳性状是单基因(O基因)控制的常染色体显性遗传性状[3]，在选育过程中杂合体也表现为绿壳性状，所以采用表型选择方法选育周期较长[4]。王哲鹏等[5]研究发现鸡3号染色体上EAV-HP的长末端重复序列反向插入到鸡的1号染色体SLCO1B3基因的启动子区，促使SLCO1B3基因过量表达，导致蛋壳呈现绿色。目前，已确定SLCO1B3基因为蛋壳呈现绿色的主效基因，但是实际生产中，尽管纯合子的绿壳蛋鸡都产绿壳蛋，但蛋壳的绿色程度却深浅不一[6]，导致这一现象的原因可能与其他影响蛋壳绿色的微效基因有关。本课题组陈林[7]对300日龄赤水乌骨鸡的蛋壳腺进行了转录组测序，筛选出丝氨酸蛋白酶抑制剂1基因(serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin),member 1,SPIA1)为蛋壳绿色深浅的上调基因。

SPIA1基因最早是在原鸡身上发现的，目前关于SPIA1基因的研究未见报道。本研究为了验证转录组测序的结果，以SLCO1B3基因作为分型基因，对赤水乌骨鸡母鸡进行基因分型，进而根据基因型及蛋壳颜色的深浅对赤水乌骨鸡进行分类，然后检测不同产蛋期不同蛋壳绿色深浅的赤水乌骨鸡母鸡蛋壳腺和肝脏中SPIA1基因的表达量，以期发现SPIA1基因的表达量与蛋壳绿色深浅之间的关系，同时鉴定与绿壳蛋颜色变异相关的基因，为绿壳蛋的遗传机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

赤水乌骨鸡由贵阳市绿源有限公司种鸡场提供，随机挑选出180、360、540日龄的品种特征明显、长势相近、健康无病的赤水乌骨鸡母鸡。

根据SLCO1B3基因设计引物，利用双重PCR对赤水乌骨鸡进行基因分型，选留绿壳纯合型和绿壳杂合型，观察每只鸡每天的产蛋时间及蛋壳颜色连续2周，按照基因型和蛋壳绿色的深浅分为6类：纯合子深绿色、纯合子浅绿色、纯合子淡绿色、杂合子深绿色、杂合子浅绿色、杂合子淡绿色。每种类型选择产蛋颜色重复性较好，产蛋时间比较规律的鸡各3只，在产蛋前2.5～3 h屠宰，屠宰后采集肝脏和蛋壳腺各20 g，用生理盐水冲洗并用锡箔纸包裹后迅速放入液氮罐内，转至-80 ℃冰箱备用。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

在GenBank中检索到鸡SPIA1基因和SLCO1B3基因mRNA的序列(两个基因的登录号分别为NM_001277493.1和NM_001318449.1)，运用Primer Primer5设计引物，引物由贵阳春满谷生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

SLCO1B3基因的PCR扩增体系为20 μL，其中DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master mix(购自天根生化科技(北京)有限公司)10 μL，加ddH2O补足20 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；35个循环(94 ℃变性30 s，退火温度51.3 ℃，退火时间30 s，72 ℃延伸40 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，在凝胶成像系统下观察基因型。

SPIA1基因的PCR扩增体系为20 μL，其中cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master mix 10 μL购自天根生化科技(北京)有限公司，加ddH2O补足20 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；35个循环(94 ℃变性30 s，退火温度52.1 ℃，退火时间35 s，72 ℃延伸40 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.2 蛋壳原卟啉和胆绿素的测定

测定方法参考刘敬寿等[8]和卜小雁[9]的方法。称取原卟啉0.36 mg，胆绿素0.26 mg，溶解于6 mL溶剂中，溶剂由浓盐酸和甲醇按1∶2的比例配制而成，漩涡振荡，避光保存12 h，分别制成原卟啉和胆绿素的标准原液[8]。将原液稀释成2、4、8、16、32、64、128、256倍，利用紫外分光光度计分别测定在412和680 nm处蛋壳溶解液的吸光值[8-9]。

1.2.3 RNA提取及逆转录成cDNA

本试验采用Trizol法提取总RNA，并将总RNA浓度稀释至1 000 ng/μL，根据逆转录试剂盒合成cDNA。

1.2.4 实时荧光定量PCR

对不同产蛋期的赤水乌骨鸡肝脏和蛋壳腺中SPIA1基因的表达量，本试验运用实时荧光定量PCR法进行检测。采用20 μL体系：SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL；反应条件按照说明书进行。

1.2.5 数据统计与分析

运用EXCEL和SPSS 18.0软件对本试验的所有数据进行统计和分析，显著水平为P<0.05，极显著水平为P<0.01，结果采用“平均数±标准差”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 SLCO1B3基因的PCR扩增

结果如图1所示：纯合子绿壳(SL/SL)产物片段大小为884 bp、杂合子绿壳(SL/W)为884和732 bp、纯合子非绿壳(W/W)为732 bp，与目标片段大小一致。

2.2 蛋壳胆绿素含量分析

表2显示，在对180日龄不同基因型的不同绿色蛋壳进行胆绿素含量测定和分析时发现：同一基因型中蛋壳绿色越深其胆绿素含量越高，且达到了极显著差异的水平(P<0.01)；蛋壳颜色相同时，杂合子和纯合子间蛋壳胆绿素含量不存在显著差异(P>0.05)。

1、2. 非绿壳纯合子；3、4. 绿壳杂合子；5、6. 绿壳纯合子；7. DL 2000 DNA Marker

表2 180日龄不同绿色蛋壳的胆绿素含量 mol/L

2.3 SPIA1基因的差异表达与蛋壳颜色深浅的关系分析

2.3.1 赤水乌骨鸡蛋壳腺中SPIA1基因的表达情况

表3结果显示，基因型相同时，蛋壳颜色越深，则SPIA1基因在其蛋壳腺中的表达量就越高。具体表现为深绿色极显著高于浅绿色和淡绿色(P<0.01)，浅绿色与淡绿色间不存在显著差异(P>0.05)，但是浅绿色中的表达量高于淡绿色中的表达量。

表3 SPIA1基因在蛋壳腺中不同颜色间的差异表达

蛋壳颜色相同时，SPIA1基因在不同基因型的赤水乌骨鸡蛋壳腺中的表达情况为：在360日龄，蛋壳颜色为深绿色时，SPIA1基因在纯合子赤水乌骨鸡蛋壳腺中的表达量极显著高于杂合子(P<0.01)；在540日龄，蛋壳颜色为深绿色时，SPIA1基因在纯合子赤水乌骨鸡蛋壳腺中的表达量显著高于杂合子(P<0.05)。其余情况下，SPIA1基因在纯合子和杂合子赤水乌骨鸡蛋壳腺中的表达量不存在显著差异(P>0.05)。

图2结果显示，纯合型深绿色或杂合型深绿色的条件下，180和540日龄的赤水乌骨鸡蛋壳腺中SPIA1基因的表达量均极显著高于360日龄(P<0.01)，180和540日龄间都不存在显著差异(P>0.05)；纯合型浅绿色或杂合型浅绿色的条件下，180日龄和540日龄的赤水乌骨鸡蛋壳腺中SPIA1基因的表达量均显著高于360日龄(P<0.05)，180和540日龄间都不存在显著差异(P>0.05)；纯合型淡绿色的条件下，180和540日龄的赤水乌骨鸡蛋壳腺中SPIA1基因的表达量显著高于360日龄(P<0.05)，180和540日龄间不存在显著差异(P>0.05)；杂合型淡绿色的条件下，不同日龄间不存在显著差异(P>0.05)，但180和540日龄的赤水乌骨鸡蛋壳腺中SPIA1基因的表达量均高于360日龄。

注：若达到极显著水平，则两图柱标注不同大写字母(P<0.01)；若达到显著水平，则标注不同小写字母(P<0.05)；若不存在显著关系，则不标注字母(P>0.05)。下同

2.3.2 赤水乌骨鸡肝脏中SPIA1基因的表达情况

表4结果显示同一基因型的赤水乌骨鸡中，产蛋的蛋壳绿色越深，SPIA1基因在其肝脏中的表达量就越高。具体表现为深绿色极显著高于浅绿色和淡绿色(P<0.01)，浅绿色高于淡绿色，但是没有达到显著差异(P>0.05)；360日龄时，杂合子的赤水乌骨鸡中SPIA1基因在肝脏中的表达量表现为深绿色显著高于浅绿色(P<0.05)，深绿色与淡绿色间无显著性差异(P>0.05)。

表4 SPIA1基因在肝脏中不同蛋壳颜色间的差异表达

蛋壳颜色相同时，360日龄，深绿色蛋壳的条件下，SPIA1基因在纯合子的赤水乌骨鸡肝脏中的表达量显著高于在杂合子中的表达量(P<0.05)；其他情况下都表现为蛋壳颜色相同时，SPIA1基因在纯合子和杂合子赤水乌骨鸡肝脏中的表达量不存在显著差异(P>0.05)。

图3结果显示，纯合型深绿色或杂合型深绿色的条件下，180和540日龄的赤水乌骨鸡肝脏中SPIA1基因的表达量均极显著高于360日龄(P<0.01)，180和540日龄间都不存在显著差异(P>0.05)；纯合型浅绿色的条件下，180和540日龄的赤水乌骨鸡肝脏中SPIA1基因的表达量显著高于360日龄(P<0.05)，180和540日龄间不存在显著差异(P>0.05)；杂合型浅绿色的条件下，180和540日龄的赤水乌骨鸡肝脏中SPIA1基因的表达量极显著高于360日龄(P<0.01)，180和540日龄间不存在显著差异(P>0.05)；纯合型淡绿色或杂合型淡绿色的条件下，180和540日龄的赤水乌骨鸡肝脏中SPIA1基因的表达量均显著高于360日龄(P<0.05)，180和540日龄间都不存在显著差异(P>0.05)。

图3 不同日龄赤水乌骨鸡肝脏中SPIA1基因的差异表达

3 讨论

蛋壳胆绿素是在肝脏中合成并由壳腺部分泌的[9]。相关研究显示，蛋壳颜色是可遗传性状，且遗传力较高，蛋壳颜色的遗传力为0.58～0.76[10-11]。蛋壳颜色是由沉积于蛋壳中的色素引起的，原卟啉和胆绿素是两种主要的蛋壳色素[12]，绿壳蛋的绿色主要是由胆绿素的沉积引起的[13-14]。因此，本试验收集180日龄的蛋壳测其胆绿素含量，并分析了胆绿素含量与蛋壳颜色之间的关系，结果显示蛋壳绿色越深其胆绿素含量越高，对SPIA1基因的表达量与蛋壳中胆绿素的含量进行相关性分析发现呈极显著正相关，与转录组测序结果SPIA1基因为蛋壳绿色的上调基因一致。

不同产蛋期的赤水乌骨鸡蛋壳腺和肝脏中SPIA1基因的差异表达分析发现，无论是纯合子还是杂合子的赤水乌骨鸡，不同产蛋期SPIA1基因的表达量均存在差异。其中360日龄时的表达量显著低于180和540日龄，180与540日龄间差异不显著，造成这一现象的原因有待于进一步研究。白激荣[15]的研究显示，由于绿壳蛋的色素是在肝脏中合成的，如果合成速度较低，产蛋率提高就会使得单个个体绿色变浅，这与本研究数据显示的结果一致。同时，相关研究显示，EVP-HP插入会使得绿壳主效基因SLCO1B3基因在绿壳蛋鸡蛋壳腺中高表达，同时减弱了其在肝脏中的表达[16]。本试验发现赤水乌骨鸡蛋壳腺中SPIA1基因的表达量明显高于肝脏组织，这与绿壳主效基因SLCO1B3基因的表达特点相似。基于以上结果，推测SPIA1基因可能是影响蛋壳绿色的微效基因。关于SPIA1基因的遗传机制尚不清楚，后续需对该基因进行深入研究。

4 结论

SPIA1基因在赤水乌骨鸡肝脏和蛋壳腺中的表达量均表现为纯合子高于杂合子，在不同基因型都表现为随蛋壳绿色加深SPIA1基因的表达量增高，与本课题组前期转录组测序的结果显示SPIA1基因为蛋壳颜色的正调控基因相符合，并且与本研究相关分析结果显示的SPIA1基因的表达量与蛋壳胆绿素含量呈极显著正相关一致，推测该基因可能为绿壳蛋颜色的正调控基因，其作用机理有待进一步研究。