4个贵州乌骨鸡群体遗传关系的微卫星标记分析

伍革民， 张 继， 唐继高

(1.贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550005； 2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550000)

贵州省地方鸡种资源丰富，其中赤水乌骨鸡等7个品种已编入《贵州省畜禽品种志》，还有一些地方鸡种如普安乌骨鸡、水西乌骨鸡等群体尚未编入，由于地理、环境等各种因素，它们缺乏规模化饲养、品种资源保护利用和开发研究。普安县乌骨鸡主产于云贵高原中段的贵州省西南部乌蒙山区普安县新店乡等地，历史上无记载，是一种独特的乌骨鸡品种，有黑羽、麻羽等羽色类型，黑羽乌骨鸡基本是农户散养，缺少专业化饲养和规模化养殖[1]。水西乌骨鸡主要产于贵州省黔西县新仁乡等地，养殖历史较长，该乌骨鸡体格健壮，对疾病的抵抗能力强，常年以青菜、统糠、稻谷等为食，耐粗饲，喜食山坡草籽、昆虫，觅食能力强，皮、骨、肉及内脏为乌色，肉质鲜美。为充分开展这些地方鸡种资源的保护和利用，有必要了解它们的遗传结构和亲缘关系。在应用于遗传结构或亲缘关系检测的多态性标记中，微卫星标记数量多，研究成熟、分布广、共显性、易于检测，因而应用广泛。本研究选择7个微卫星标记对普安乌骨鸡、赤水乌骨鸡、水西乌骨鸡和广西乌骨鸡的遗传多样性进行检测，并分析饲养于贵州省的4个乌骨鸡群体间的遗传关系，可为这些品种或群体的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用的4个鸡品种为普安乌骨鸡、赤水乌骨鸡、水西乌骨鸡和广西乌骨鸡，其中普安乌骨鸡、赤水乌骨鸡和水西乌骨鸡是贵州省本地长期饲养和培育的地方鸡种，广西乌骨鸡从广西壮族自治区东兰县引进，后在贵州长期饲养。每个品种样本数为30羽，采用翅下静脉采血1.0～1.5 mL/羽，-20 ℃保存。

参考国内外文献报道[2～7]，选择位点分布多的7对微卫星标记。引物位置、退火温度及序列等信息见表1。

1.2 方法

采用血液DNA提取试剂盒提取DNA。20 μL PCR反应体系包括2×TaqPCR MasterMix 10 μL、引物各1 μL、100 ng/μL 模板DNA 1 μL、去离子水7 μL。PCR反应程序：94 ℃预热3 min后进行35个PCR循环，然后72 ℃延伸 5 min。35个PCR循环参数包括95 ℃变性30 s，退火30 s(退火温度见表1)，72 ℃延伸30 s。1.0%～1.5%琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，8%～10%聚丙烯酰胺凝胶分离PCR产物，银染显色和凝胶成像照相保存，使用Labworks软件分析片段大小并进行分型。

1.3 数据统计分析

1.3.1 群体内遗传多样性分析 等位基因数、有效等位基因数、等位基因频率、观测和期望杂合度、种群近交系数等遗传多样性指标使用PopGen 3.2软件进行统计和分析。多态信息含量(polymorphism information content，PIC)根据以下公式计算：

表1 7对微卫星引物信息

式中：n为等位基因数；Pi和Pj分别为群体中第i个和第j个等位基因频率。

1.3.2 群体间遗传关系分析 根据等位基因频率，利用PopGen 3.2软件计算4个群体之间的遗传距离，构建4个乌骨鸡群体系统发生树。

2 结果与分析

2.1 微卫星DNA多态性检测结果

7个微卫星标记(MCW0005、MCW035、MCW0166、LEI0217、LEI0089、ADL16、ADL201)分别检测出5、4、3、4、6、6、4个等位基因。等位基因频率见表2。

表2 4个乌骨鸡鸡群体等位基因频率

2.2 群体内遗传多样性

4个乌骨鸡群体7个微卫星座位平均基因杂合度(H)和多态信息含量(PIC)见表3。

从表3可知，试验用的4个鸡群体在7个微卫星基因座均表现出较高的基因杂合度，各群体平均杂合度为0.727 2(0.706 9～0.738 5)，其中杂合度最高的是赤水乌骨鸡的ADL166座位，为0.802 8。在4个乌骨鸡群体中，各基因座群体杂合度和多态信息含量均大于0.50，说明7个微卫星基因座在这些鸡群体中遗传变异幅度较大。不同基因座在不同群体中杂合度和多态信息含量存在差异，其中广西乌骨鸡多态信息含量和杂合度最高。

表3 4个乌骨鸡鸡群体7个微卫星座位的杂合度和多态信息含量

2.3 群体间遗传关系

4个乌骨鸡群体间的遗传距离见表4。由表4可知，4个鸡群体遗传距离均较近，在0.05以下，其中广西乌骨鸡和水西乌骨鸡之间的遗传距离最远，为 0.044 8，与赤水乌骨鸡的遗传距离最近，为0.019 4。

表4 4个乌骨鸡群体之间的标准遗传距离(Ds)

根据Nei氏标准遗传距离[8]，应用PopGen 3.2软件中的UPGMA程序构建的系统发生树，结果见图1。从图1可知，4个鸡群体可以分为三大类：水西乌骨鸡聚为一类，普安乌骨鸡聚为一类，赤水乌骨鸡和广西乌骨鸡聚为一类。

3 讨论与结论

3.1 微卫星DNA多态性与群体内遗传多样性

为准确说明一个群体或品种的遗传多样性水平，应选用在该群体内多态性含量高的基因座位进行检测和分析。采用多态信息含量(PIC)来衡量基因座多态性情况，当PIC>0.5时，该座位高度多态。本研究中用于多样性分析的7个微卫星座位在所有5个群体中的多态信息含量均在0.5以上，因此本试验的结果具有一定的参考价值。采用杂合度来评估群体内遗传变异程度，本研究中的4个乌骨鸡群体的7个微卫星座位的平均杂合度在0.706 9～0.738 5，均在 0.70 以上，说明4个乌骨鸡群体遗传多样性丰富，同时也说明在利用与推广这些地方群体时，还必须对其进行进一步纯繁选育。上述鸡养殖方式基本为散养，缺乏系统选育，说明研究结果与实际情况相符。

3.2 群体间遗传关系

赤水乌骨鸡主产于贵州省赤水市，又名竹乡鸡，属于蛋肉兼用型地方品种[9-10]；普安乌骨鸡主产于贵州省西南部乌蒙山区普安县新店乡等地，历史上无记载，是一种独特的乌骨鸡品种；水西乌鸡主产于黔西县新仁乡，养殖历史悠久；普安乌骨鸡和水西乌鸡均未入《贵州省品种志》，很少开展资源保护评价和开发利用；广西乌骨鸡从广西壮族自治区东兰县引进，后在贵州长期饲养。从本研究根据遗传距离对上述4个乌骨鸡群体构建的系统发生树来看，广西乌骨鸡与赤水乌骨鸡遗传距离近，聚为一类，可能与这2个鸡种进化及育种历史相似、均属于蛋肉兼用型乌骨鸡品种有关。水西乌骨鸡与普安乌骨鸡各自聚为一类，可能是地理、气候等因素造成的。上述4个乌骨鸡群体之间的遗传距离较小，均在 0.05 以下，这可能与它们均属于乌骨鸡有关。