和营清热方及其主要单体抗糖基化终末产物生成研究

王蕾蕾，俞莹，陶津华，孔令春，缪晚虹，邹红

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是一种以视网膜微血管病变为主要病理变化的糖尿病严重并发症。在众多病理进程中糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）的积累是DR 发生的重要机制之一[1]，它是由过多积累的糖与脂质、蛋白、核苷酸携带的游离氨基酸结合形成，能够诱导周细胞凋亡、内皮细胞增生，破坏视网膜血管的完整性，导致血管渗漏、微血管瘤的形成等。此外，AGEs 的过多积累还可以引起多种因子如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、细胞间粘附因子-1（intercellular adhersion molecule-1，ICAM-1）的过度表达，导致视网膜中的血管新生、白细胞停滞。AGEs 与AGEs 受体（receptor for AGES,RAGE）结合时引发炎症，导致血栓生成[2]，加重DR。故AGEs 的生成是DR 产生的一个重要病理因素，探索抑制其合成对控制DR 的发展具有积极作用。

和营清热方（heying qingre formula，HF）是上海名老中医邹菊生先生的经验方，临床用于治疗早期DR。本课题通过使用和营清热方及其主要单体干预体外糖基化终末产物合成过程，探讨其保护DR 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药物

中药生药（购于香港大学中医药学院中药房）；糖基化终末产物（Millipore 公司，美国）；氨基胍（Sigma 公司，美国）；乙腈，HPLC 级（DUKSAN 公司，日本）；绿原酸、牛蒡子苷、阿魏酸、芦丁、槲皮素、梓醇，HPLC≥98%（上海融禾药物股份有限公司）；葡萄糖、果糖（Sigma 公司，美国）。

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪（Waters 公司，美国）；C18 色谱柱（250 mm×4.0 mm，5 μm，ACE，英国）；荧光光谱仪（LS55，PerkinElmer，美国）。

1.3 中药提取及成分鉴定

HF 共含8 味中药，分别为金银花、当归、玄参、生地黄、枸杞子、黄精、蒲公英、牛蒡子，除蒲公英（为其他药的2.5 倍量），其他各药等量。生药经粉碎、混合后，浸泡在10 倍体积的去离子纯净水中，水煎2 次，每次1h。混匀两次水煎液通过真空蒸馏浓缩为2 g/ml，过滤后储存于-20℃备用。

为鉴定该复方中有效化学成分，本研究使用高效液相色谱法对其进行检测。经筛选，查阅文献后选取绿原酸、牛蒡子苷、阿魏酸、芦丁、槲皮素及梓醇单体标准品为药物单体标准品进行鉴定，选用乙腈与0.05%KH2PO4（pH=2.5）为流动相，色谱分离条件如表1 所示，检测波长为235 nm。

表1 和营清热方的高效液相色谱分析条件

1.4 造模方法

糖基化终末产物合成模型建立，以果糖为基底合成AGEs：10 g/L 牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA）与250 mM 果糖溶解于0.2 M 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=7.4）中，无菌条件下置于37℃培养6 d。以葡萄糖为基底合成AGEs：将50 mg/ml BSA 与144 mg/ml 葡萄糖溶于0.2 M PBS（pH=7.4）中，无菌条件置于37℃培养7 d。

1.5 分组及给药方法

在以果糖和葡萄糖为底物合成糖基化终末产物的模型组的基础上，加入氨基胍、HF 溶液或HF 主要单体成分观察HF 或单体对其合成有无抑制作用。分组依次为：（1）空白对照：BSA+PBS；（2）模型组：给药方法详见造模方法（以果糖或葡萄糖为基底）；（3）阳性对照组：模型组+氨基胍（20 mM）；（4）HF 组：模型组+不同浓度HF（分别为8、40、200、1000 μg/ml）；（5）绿原酸组：模型组+不同浓度绿原酸（分别为0.08、0.4、2、10 mM）；（6）阿魏酸组：模型组+不同浓度阿魏酸（分别为0.08、0.4、2、10 mM）；（7）牛蒡子苷组：模型组+不同浓度牛蒡子苷（分别为0.08、0.4、2、10 mM）。

1.6 观察指标

培养结束后，使用PerkinElmer 荧光光谱仪检测各组荧光值，激发波长及发射波长分别设置为370 nm及440 nm。

1.7 统计学方法

采用SPSS18.0 进行统计分析。首先进行正态性检验及方差齐性检验。若数据符合正态分布，则用表示，若数据不符合正态分布，则用中位数形式表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett T3 检验进行分析，以P<0.05，为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 和营清热方抑制糖基化终末产物体外合成

通过体外合成AGEs 观察HF 是否能够抑制其生成。结果显示，无论是在葡萄糖为底物还是以果糖为底物时，与正常组相比，模型组能够明显提高AGEs 的含量（果糖组P=0.000，葡萄糖组P=0.000）；与模型组相比，阳性对照药物氨基胍能够明显降低AGEs 的含量（果糖组P=0.000，葡萄糖组P=0.000）。

2.1.1 以果糖为底物合成AGEs 培养末AGEs 浓度组间比较，F=925.114，P=0.000。与模型组相比，浓度为8 μg/ml 和营清热方具有促进AGEs 合成的功能，且具有统计学意义（P=0.018），但浓度为40 μg/ml（P=0.023），200 μg/ml（P=0.000）及1000 μg/ml（P=0.000）能够降低AGEs 合成量，具有统计学意义，且抑制作用与药物浓度呈正相关（图1）。

图1 和营清热方抑制以果糖为底物体外合成糖基化终末产物。图2 和营清热方抑制以葡萄糖为底物体外合成糖基化终末产物。

2.1.2 以葡萄糖为底物合成AGEs 培养末AGEs 浓度组间比较，F=2030.920，P=0.000。与模型组相比，浓度为8 μg/ml 和营清热方也具有促进AGEs 合成的功能，且具有统计学意义（P=0.036），浓度为40 μg/ml干预组无明显差异（P=0.546），而浓度为200 μg/ml（P=0.000）及1000 μg/ml（P=0.000）HF 干预组能够降低AGEs 合成量，具有统计学意义，且抑制作用与药物浓度呈正相关（图2）。以上说明和营清热方能够显著抑制AGEs 的体外合成，浓度越大，抑制作用越明显。

图3 和营清热方的指纹图谱。峰3 绿原酸；峰5 阿魏酸；峰8 牛蒡子苷

2.2 和营清热方的指纹图谱

本研究使用HPLC 对HF 提取物进行质谱分析，共分离出10 个色谱峰。通过比对绿原酸、牛蒡子苷、阿魏酸、芦丁、槲皮素及梓醇标准样品的保留时间及紫外光谱，共鉴定出3 个单体成分，分别为绿原酸（峰3）、阿魏酸（峰5）及牛蒡子苷（峰8）（图3）。

2.3 HF 的3 种主要单体干预糖基化终末产物体外合成作用

本研究又分别使用筛出的3 种主要单体：绿原酸、阿魏酸、牛蒡子苷分别干预糖基化终末产物体外合成过程，每种药物浓度均依次为0.08 mM，0.4 mM，2 mM，10 mM，观察该3 种单体是否有抑制糖基化终末产物合成的作用。结果显示，3 种单体干预实验中，只有绿原酸对以葡萄糖或果糖为基底合成的糖基化终末产物合成显示出良好的抑制作用（图4），阿魏酸和牛蒡子苷无明显作用甚至促进作用（图5、6）。

图4 绿原酸抑制糖基化终末产物合成。4A 以葡萄糖为底物；4B 以果糖为底物

图5 阿魏酸干预糖基化终末产物合成。5A 以葡萄糖为底物；5B 以果糖为底物

图6 牛蒡子苷干预糖基化终末产物合成。6A 以葡萄糖为底物；6B以果糖为底物

2.3.1 绿原酸 干预以葡萄糖为基底合成AGEs 实验中（图4A），培养末AGEs 浓度组间比较，F=77.672，P=0.000。与模型组相比，4 种浓度的绿原酸均能降低AGEs 合成，但浓度为0.08 mM 的药物组无统计学意义（P=0.234），同时浓度为0.4 mM（P=0.001）、2 mM（P=0.002）及10 mM（P=0.000）的绿原酸具有显著统计学意义。在以果糖为基底合成AGEs 实验中（图4B），培养末AGEs 浓度组间比较，F=119.999，P=0.000。与模型组相比，低浓度绿原酸包括0.08 mM 和0.4 mM具有促进AGEs 合成的作用，但无统计学意义（P=0.073，P=0.080），但浓度为2 mM、10 mM 绿原酸能够抑制AGEs的体外合成，且具有统计学意义（P=0.000,P=0.000）。

2.3.2 阿魏酸 干预以葡萄糖为基底合成AGEs 实验中（图5A），培养末AGEs 浓度组间比较，F=114.971，P=0.000。与模型组相比，低浓度0.08 mM（P=0.361）及0.4 mM（P=0.236）阿魏酸轻度抑制AGEs 合成，但无统计学意义。稍高浓度2 mM（P=0.019）和10 mM（P=0.008）阿魏酸具有促进AGEs 合成作用，且具有统计学意义。在以果糖为基底合成AGEs 实验中（图5B），培养末AGEs 浓度组间比较，F=81.236，P=0.000。与模型组相比，4 种浓度具均具有促进AGEs 合成作用，但仅0.4 mM（P=0.003）及2 mM（P=0.000）组结果具有统计学意义。

2.3.3 牛蒡子苷 干预以葡萄糖为底物合成AGEs实验中（图6A），培养末AGEs 浓度组间比较，F=38.924，P=0.000。与模型组相比，仅有高浓度组10 mM 具有统计学意义（P=0.030），且存在促进AGEs 合成作用，余3种浓度无统计学差异。在以果糖为底物合成AGEs 实验中（图6B），培养末AGEs 浓度组间比较，F=115.161，P=0.000。与模型组相比，4 种浓度均存在促进其合成作用，且3 种较高浓度具有统计学意义（0.4 mM 组P=0.000，2 mM 组P=0.000，10 mM 组P=0.000）。

3 讨论

上海名老中医邹菊生先生认为，糖尿病变生目疾病机为胃火偏旺，灼津成瘀，留阻脉道，脉络瘀滞，久瘀成热，瘀热则津伤，血不循经则溢于脉外，后期久病致气阴两虚。故针对早期糖尿病视网膜病变，他主张以和营清热为主，以外科治疗脉管炎经典方——四妙勇安方加蒲公英等助银花清热解毒之效，生地助玄参滋阴增液活血之效等，拟名和营清热方进行治疗。其临床疗效已被多次验证[3-4]，其对非增殖期、增殖期糖尿病视网膜患者，以及联合激光进行干预该病，均可有效提高患者视力，改善其眼底渗出、黄斑水肿等眼底改变，提高治疗疗效。

过多的血糖使得糖基化终末产物大量积累，糖尿病造成大量AGEs 积累，除了诱发内皮细胞、周细胞功能紊乱外，还能够促进血管内皮生长因子VEGF、MCP-1、ICAM-1 表达，激活核转录因子NF-κB、NADPH，从而加速DR 发生[7-8]。AGEs 即葡萄糖、果糖等还原糖与蛋白质、脂质、核算的氨基残端结合，经过一系列复杂的非酶促美拉德反应如脱水、重排、压缩而形成的结构多样的不可逆的复杂聚合物。现代研究多采用生物化学方法以白蛋白、葡萄糖或果糖为底物，模拟人体恒温、无菌条件，体外培养数日合成该物质，通过使用荧光光谱仪检测荧光强度，用来确定AGEs 的浓度[9]。氨基胍是目前基础研究方面最为有效的抑制AGEs 的抑制剂[10]，但由于潜在的毒性及副作用未能成功应用于DR 病人[11]，寻找抑制AGEs 形成的药物是DR 的重要潜在治疗方法。

随着中医药逐步走向国际化，研究方法也逐渐向国际标准化靠拢。中药复方的组成较为复杂，药物单体是复方构成的基础成分，所以本实验通过液相质谱分析筛选出主要单体，并探究其是否与主方功效一致。实验结果表明，HF 全方具有明显抑制AGEs 合成的作用，其组成单体之一绿原酸也显示同样的作用，但同时其另外两种组成单体牛蒡子苷和阿魏酸却无明显抑制作用，甚至存在促进AGEs合成的功效。国外文献中也曾有过类似报道，Kim[12]等人发现绿原酸能够抑制糖尿病大鼠视网膜中AGEs 的生成，且能降低AGE/RAGE 复合体的活性，从而发挥对AGEs 的保护作用。由此提示，HF 对于AGEs 的合成具有良好的抑制作用，且绿原酸是HF中发挥抗AGEs 合成的重要有效成分之一，这可能是HF 发挥良好抗AGEs 的重要药理机制。

HF 的指纹图谱发现，绿原酸并非HF 的唯一组成单体，也并非HF 中含量最多的单体。由此可见，中药复方中发挥某一药理作用的不一定是其主要组成单体，单体的作用功效与其含量未必成正相关关系。中药复方在炮制过程中单体之间很可能形成了新的化合物或发生了某种化学反应，通过简单的单体样品检测未必能够发现这些新成分的存在，所以在研究中药复方的有效作用成分中，使用更为精确的检测方法十分必要。另外，本实验是探索HF 及单体抗AGEs 合成作用，虽然本实验中牛蒡子及阿魏酸与主方没有体现药理作用的一致性，但仍有可能以其他机制发挥保护DR 作用，共奏临床疗效，所以探索HF 的其他有效成分及药理机制需要进一步研究。