基于网络药理学分析桃红四物汤治疗股骨头坏死的机制

王 雷, 陈 坤

(陕西中医药大学附属医院 骨病科, 陕西 咸阳, 712000)

股骨头坏死(ONFH)属中医“骨蚀”“骨痹”范畴，与气滞血瘀、气血运行不畅、骨失所养有关[1]。现代医学[2]认为, ONFH与创伤、劳损、激素、饮酒及放射线等因素相关。ONFH治疗重点在于改善血供、恢复血运、促使新骨形成，而中药活血化瘀方治疗本病具有一定的优势。临床研究[3]证实，桃红四物汤可有效改善血液流变学及黏滞性，进而达到活血化瘀、改善微循环的目的。桃红四物汤作为治疗ONFH的经典方剂，其疗效确切，但药理机制尚未完全阐明，本研究采用网络药理学方法，从活性成分、靶点、分子结合潜力、GO富集分析和KEGG信号通路的角度对其进行探析，以期为桃红四物汤治疗ONFH提供新的理论参考。

1 资料与方法

1.1 桃红四物汤的活性成分及靶点挖掘

采用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索每味中药的活性成分，筛选标准为口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18, 获取符合条件的活性成分。对不满足筛选要求但含量高或者活性强的活性成分，则予以手动添加。再依据TCMSP数据库将活性成分与潜在靶点逐一配对，然后运用Uniprot数据库筛选物种为“Homo sapiens”的靶点，作为桃红四物汤活性成分靶点。

1.2 股骨头坏死相关靶点获取

以“femoral head necrosis”“osteonecrosis of the femoral head”为检索词，分别从OMIM(http://www.omim.org)、Drugbank(https://www.drugbank.ca/)、Genecards(https://www.genecards.org)数据库中检索与ONFH相关的靶点，重复靶点保留1个，所得靶点即为ONFH相关靶点。

1.3 网络构建与分析

将桃红四物汤活性成分靶点与ONFH相关靶点取交集，并与桃红四物汤活性成分一一对应; 采用Cytoscape3.7.2软件构建活性成分-靶点网络图; 将交集靶点输入到String数据库(https://string-db.org/), 物种设置为“Homo sapiens”, 最低相互作用阈值设为最高置信度“highest confidence(0.9)”, 得到蛋白互作(PPI)网络信息，然后采用Cytoscape3.7.2软件将PPI网络进行可视化处理。以介数(Betweenness)和自由度(Degree)的均值作为截点，将截点之上的靶点作为关键靶点，并分析其药理作用。

1.4 分子对接评估结合潜力

利用Systems Dock Web Site服务器，将关键靶点与桃红四物汤的活性成分进行分子对接，并对对接分数(Docking score)进行分析，评估桃红四物汤活性成分与靶点间的结合潜力。

1.5 GO富集及KEGG信号通路富集分析

将筛选出的关键靶点输入到Metascape数据分析平台进行GO生物过程富集和KEGG信号通路富集分析。依据富集基因数，选取前20位生物学过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组成(CC)和KEGG信号通路进行分析。

2 结 果

2.1 桃红四物汤活性成分及靶点

桃红四物汤活性成分共有730个，以OB值≥30%, DL值≥0.18为标准进行筛选，再结合手动筛选得到69个活性成分，在TCMSP数据库中将其与潜在靶点逐一配对，重复靶点仅保留1个，共得到187个靶点。

2.2 股骨头坏死靶点

从OMIM、Drugbank及GeneCards数据库中分别检索股骨头坏死(“Femoral head necrosis” “osteonecrosis of the femoral head”)相关靶点，重复靶点保留1个，共得到1 927个相关靶点。

2.3 网络构建与分析

将187个活性成分靶点与1 927个ONFH相关靶点进行映射，得到共同靶点110个，见图1。利用Cytoscape3.7.2软件建立活性成分与靶点相互作用网络，共有171个节点和298条边，见图2。位居前3位的活性成分为槲皮素、山奈酚、木犀草素，推测其可能是桃红四物汤治疗ONFH的主要活性成分。

图1 桃红四物汤与股骨头坏死靶点韦恩图

紫色圆点代表靶点，绿色方点代表活性成分。

为进一步研究桃红四物汤治疗ONFH的作用机制，本研究利用STRING数据库和Cytoscape3.7.2软件将110个交集靶点进行PPI网络分析，见图 3。网络中所有靶点均可以发生相互作用，蛋白间相互作用共产生2 113条边，超过介数和自由度均值的靶点为血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-6(IL-6)以及成骨细胞特异性转录因子(Runx2), 认为其可能是桃红四物汤治疗ONFH的主要靶点。

图3 桃红四物汤蛋白互作网络图

2.4 分子对接结果

在分子对接服务器中输入主要靶点的PDB数据库ID, 与桃红四物汤69个活性成分进行对接并评估其活性。结果有32个对接分数值大于7.00, 其中VEGF有13个、IL-6有8个、Runx2有11个; 有60个对接分数值位于5.10和7.00之间; 有45个对接分数值位于4.26和5.00之间; 小于4.26的有10个。对接分数值大于5.00表示结合能力较强，大于7.00表示结合能力很强，提示桃红四物汤的活性成分与靶点可紧密结合。见图4。

图4 分子对接的对接分数值

2.5 GO富集与KEGG信号通路富集

GO富集分析结果，见图5。其中分子功能主要富集在转录因子结合、类固醇激素受体活性、蛋白激酶结合、细胞因子受体结合、蛋白质结构域特异性结合、核激素受体结合等方面。生物过程主要涉及到细胞因子介导的信号通路、对类固醇激素的反应、细胞凋亡信号通路等生物学过程，说明桃红四物汤可通过调控多个生物过程治疗ONFH。细胞组成包括核转录因子复合体、蛋白激酶复合体、蛋白质-DNA复合物、线粒体外膜、细胞外基质等。KEGG信号通路富集分析结果，见图6。其中有3条通路与股骨头坏死密切相关，分别是VEGF、Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)及 核转录因子-kappa B(NF-κB)信号通路，提示桃红四物汤可通过多途径作用于ONFH。以JAK/STAT信号通路为例，桃红四物汤治疗ONFH的潜在靶点和作用机制见图7。

图5 桃红四物汤治疗股骨头坏死关键靶点GO富集分析图

图6 桃红四物汤治疗股骨头坏死关键靶点KEGG通路富集分析图

图7 JAK/STAT信号通路图

3 讨 论

桃红四物汤出自清朝吴谦等所著的《医宗金鉴》，由桃仁、红花、熟地、川芎、白芍、当归组成[4], 具有活血化瘀、消肿止痛及补血和血之效。研究[5]表明，桃红四物汤具有改善局部血液循环、消除充血水肿的作用。方中桃仁、红花活血化瘀; 川芎行气理血; 熟地滋阴补血; 当归活血补血; 白芍柔肝养血，缓急止痛。全方精炼，组方严谨，诸药合用，共奏活血化瘀、消肿止痛、补血和血之功，为“瘀去、新生”创造了有利条件。

中药复方作为理、法、方、药中重要的一环，具有药味多、靶点多、成分复杂等特点，因此用传统方法研究中药复方尚有一定难度。网络药理学作为连接中医和现代医学的桥梁，能够将二者有效地融合起来，使中药复方的作用机理从分子水平方面探讨成为可能。

中医认为，血瘀是ONFH的主要病因，治疗关键在于活血化瘀。现代医学[6]认为，血瘀主要涉及到微循环障碍、血管内皮细胞损伤、凝血与抗凝血以及血小板功能等方面。木犀草素、槲皮素、山奈酚是桃红四物汤治疗ONFH的主要活性成分，研究[7-9]证实槲皮素、山奈酚具有抗炎、抗凝血、改善血流动力学的作用。同时现代药理学研究[10-11]亦表明，槲皮素能抑制凝血酶的活性，防止血液凝固以及形成纤维蛋白凝块，山奈酚可抑制血栓的形成及血小板的活化。学者[12]发现，木犀草素具有舒张血管作用，且为非内皮依赖性，其作用机制与细胞内钙释放以及激活钾通道相关。

桃红四物汤治疗ONFH的主要靶点有3个, VEGF是调控血管形成的关键因子并参与血管重建[13], 可增强血管通透性，使血浆纤维蛋白沉积，为参与血管生成的细胞提供纤维支架[14]。有动物实验[15]发现，血管内皮生长因子165(VEGF165)基因能够显著促进ONFH区血管新生，为ONFH的修复创造条件。IL-6是重要的骨代谢调节者，可促进成骨分化，其机制与激活JAK/STAT信号通路相关。Runx2能够调控成骨细胞的分化并促进其成熟，对修复骨坏死作用明显[16], 同时可调控骨钙素的表达，骨钙素是评价骨形成的优良指标[17]。洪郭驹等[18]指出Runx2在ONFH的修复及重建中扮演重要角色。桃红四物汤主要通过血管新生、调节骨代谢、促进成骨分化治疗ONFH。

GO富集分析中，分子功能与生物过程富集的结果与PPI网络分析的规律相一致，所展示的分子功能、生物过程与ONFH发病机制相符合; ONFH相关基因富集于该过程，引起ONFH。富集的基因多为桃红四物汤相关基因，提示桃红四物汤通过调控该生物过程，以达到治疗ONFH的目的。

KEGG通路富集分析发现，与股骨头坏死明显相关的通路有3条。NF-κB信号通路在免疫调节与炎症反应中起重要作用，研究[19]指出ONFH与炎性因子密切相关，当炎性因子与受体结合后, NF-κB从复合物中释放出来，激活炎性因子，增强炎症反应，进而促进ONFH的发生、发展[20]。研究[21]证实，抑制NF-κB表达可促进成骨细胞分化，其机制与减少炎性因子释放有关。VEGF信号通路在ONFH的发生、发展过程中发挥着重要作用, VEGF是调控血管生成的关键因子，为血管生成提供分子靶点[22]。研究[23-24]指出抑制蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子与激活子3(JAK2/STAT3)通路，可促进血管生成，改善ONFH区的微环境，进而对ONFH起到修复作用，此结果与翁艳等[25]结论一致。桃红四物汤能够利用多个信号通路产生作用。

综上所述，本研究采用网络药理学方法，对桃红四物汤治疗ONFH成分、靶点间的相互作用进行探讨，为作用机制的分析提供了理论依据，对深入探索桃红四物汤治疗ONFH的机制具有重要的参考意义。