琥珀蚕丝腺转录因子基因AaSGF-1的克隆、原核表达及组织表达分析

李琼艳,陈安利,荀利杰,刘增虎,廖鹏飞,杨伟克,董占鹏,*

(1.云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所,云南蒙自 661101;2.安康学院,陕西安康 725000)

转录因子是参与真核细胞转录调控并广泛存在于动植物细胞中的一类蛋白质，能直接或间接地与特异的DNA调控元件结合，从而调控目的基因的转录(Kaufmann and Knochel,1996)。Fox(forkhead box)蛋白是一大类含高度保守Forkhead box结构域的转录因子，Weigel等(1989)和 Weigel和Jäckle (1990)首次克隆鉴定到了黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的Fork head (FKH)基因，并发现该基因调控果蝇早期胚胎、肠道、外胚层的发育。此后，这类结构高度保守的转录因子相继在小鼠Musmusculus、非洲爪蟾Xenopuslaevis和秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans等物种中被发现，并统一命名为Fox基因(Kaestneretal.,2000)。目前，Fox蛋白家族已经在包括家蚕Bombyxmori(Matsunoetal.,1990;Machetal.,1995)在内的一百多种动物和真菌物种中被发现或预测，并有研究表明该基因家族参与调控细胞增殖分化及凋亡(Myat and Andrew,2000;Salih and Brunet,2008)、胚胎发育(Weigeletal.,1989;Hoodlessetal.,2001)、形态建成(Friedman and Kaestner,2006)、机体衰老(van de Horst and Burgering,2007)、糖脂代谢(Kaestner,2000；Costaetal.,2001)和免疫应答(Jacksonetal.,2010;Benayounetal.,2011)等生物学过程。

Matsuno等(1990)在家蚕后部丝腺细胞中发现了一类高量表达的作用因子，并将其命名为丝腺转录因子SGF-1(silk gland factor 1)；Mach等(1995)通过序列比对发现SGF-1蛋白含保守的Forkhead结构域，是Forkhead家族的新成员，属FOX A亚家族，这是在家蚕体内克隆出来的第一个属于Fox家族的基因。有研究表明SGF-1不仅能激活丝胶1(sericin-1,ser-1)基因的转录(Matsunoetal.,1989;Machetal.,1995)，还可与其他转录因子协同调控丝素轻链 (fibroin light chain,fib-L)基因、丝素重链 (fibroin heavy chain,fib-H)基因和P25基因的转录表达(Durandetal.,1992;Horardetal.,1997;Takiyaetal.,1997)。另外，Kokubo等(1996)利用原位杂交和免疫组化的方法发现SGF-1可能参与了家蚕胚胎期肠道、丝腺和中枢神经系统等器官的发育，运用RNAi技术在家蚕胚胎期对SGF-1基因进行干涉，结果发现轴索发育受到影响，说明SGF-1在家蚕神经发育过程中起着不可或缺的作用(Liuetal.,2016)。

琥珀蚕Antheraeaassama属鳞翅目(Lepidoptera)大蚕蛾科(Saturniidae)柞蚕属Antheraea绢丝昆虫，其丝以耐磨和富有金黄色光泽而闻名，与家蚕丝相比有更好的强伸力、更强的吸湿性，并具有优良的生物学特性(Lucasetal.,1960;Sen and Murugesh,2004;Goujonetal.,2012)，在纺织、生物医药、生物材料等领域有较好的开发利用潜力，经济价值较高。然而，琥珀蚕具有典型的野蚕特性，卵孵化严重不齐，且丝蛋白组成及滞育性都与家蚕存在差异，所以AaSGF-1是否参与琥珀蚕丝腺发育及丝蛋白合成都未可知。本研究结合RT-PCR与RACE方法克隆了琥珀蚕AaSGF-1基因，并利用生物信息学对基因序列及其编码蛋白的理化特性进行分析；通过原核表达得到目的蛋白，制备多克隆抗体验证特异性，利用免疫荧光技术检测AaSGF-1在琥珀蚕丝腺中的表达情况，为进一步研究AaSGF-1基因在琥珀蚕丝腺发育及其在丝蛋白合成过程中的转录调控分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的琥珀蚕及蚕卵由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所驯养保存。蚕卵于室温催青孵化，幼虫于室内用新鲜天竺桂枝条饲养。取5龄第4天幼虫的头、中肠、脂肪体、丝腺、血液、表皮等组织器官，其中丝腺组织包括前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺。获取的上述材料于液氮中速冻后，在-80℃条件下保存备用。

1.2 总RNA提取及cDNA第1链合成

取1.1节中-80℃超低温冰箱保存备用的琥珀蚕组织样品，利用RNA Plus(TaKaRa)提取组织总RNA，以1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，用超微量分光光度计(IMPLEN N50T)测定RNA样品的浓度和纯度(OD260/OD280)。用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反转录试剂盒反转录合成cDNA，并置于-20℃保存备用。

1.3 琥珀蚕AaSGF-1基因的克隆

根据GenBank中登录的家蚕丝腺转录因子SGF-1基因的核苷酸序列(GenBank登录号:NP_00103732)设计引物，上游引物SGF-1-F:5′-ATGATCTCGCAGAAGCTTTC-3′；下游引物SGF-1-R:5′-TCACAAGGGCGGCTGGGCGT-3′。以1.2节获得的丝腺cDNA为模板，进行SGF-1基因完整ORF的PCR扩增，反应体系:rTaq 0.1 μL,10×Buffer 2 μL,dNTP Mix 1 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,模板2 μL,RNA free H2O 12.9 μL。扩增程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶、纯化、回收，并克隆到pMD19-T质粒，重组载体转化大肠杆菌EscherichiacoliTop10感受态细胞，经菌液PCR鉴定后送样测序。根据所获得的SGF-1基因的序列设计3′-RACE和5′-RACE特异性引物，SGF-1-3′F:5′-GAACTCT GCCTCCCCGAGCACACG-3′;SGF-1-5′R:5′-AGA GATTCGGATAGGGCTGTGCTG-3′。按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(TaKaRa)试剂盒的说明书进行扩增，扩增回收产物与pMD19-T载体连接，经菌液PCR鉴定后送样测序。

1.4 目的基因的生物信息学分析

利用Compute pI/Mw(http:∥web.expasy.org/compute_pi/)对1.3节克隆的目的基因所编码的蛋白质分子质量与等电点进行预测；利用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)进行结构域预测；利用PSIpred(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred_new/)对蛋白质二级结构进行预测，利用BioEdit软件对序列进行拼接，利用DNAStar软件中的MegAlign组件对目的基因以及NCBI数据库中其他物种SGF-1蛋白和FKH蛋白的氨基酸序列进行相似性分析；用ClustalX1.83软件对筛选的氨基酸序列进行多序列比对，并用MEGA 6.0(Tamuraetal.,2013)软件的最大似然法(maximum likelihood method)构建系统进化树。

1.5 qPCR检测目的基因组织表达谱

以1.2节中获得的各组织的cDNA为模板，根据1.3节克隆的基因序列设计定量引物qAaSGF1-F:5′-GGTGAAGATAAAGAAATGCG-3′；qAaSGF1-R:5′-CCGTGTGATGCTGAATGG-3′。以β-actin为内参基因(陈安利等,2018)，引物序列为:β-actin-F:5′-CAAAACATTCAACACCCCCG-3′;β-actin-R:5′-TGGCGTGAGGCAGTGCGTAA-3′。在荧光定量PCR仪StepOne Plus Realtime PCR System (Applied Biosystems)上进行qPCR检测。参照罗氏荧光定量试剂盒说明书配制反应体系:SYBR Premix Ex Taq (Roche,2×) 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,模板2 μL,RNase-free H2O 6.4 μL。PCR扩增程序:95℃ 1 min;95℃ 30 s,58℃ 1 min,共40个循环。3头蚕为1样本，实验设置3次重复，数据用2-ΔCt法进行相对定量分析。

1.6 原核表达及纯化

根据1.3节克隆的琥珀蚕AaSGF-1基因的完整序列设计原核表达载体构建所需的引物：AaSGF-1-BamHI-F:5′-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGAT CTCGCAGAAGCTCTCG-3′(下划线序列为BamHⅠ酶切位点)；AaSGF-1-EcoRI-R:5′-GCTTGTCGA CGGAGCTCGAATTCTCACAAGGGCGGCTG -3′(下划线序列为EcoRⅠ酶切位点)，以琥珀蚕丝腺cDNA为模板进行PCR扩增。用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切PCR产物及pET-28a(+)载体并连接，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株；利用0.5 mmol/L的IPTG在37℃下诱导4 h进行蛋白小量诱导表达检测。小量诱导表达成功后进行大批量诱导，挑单菌落于10 mL LB液体培养基(卡那抗性)中，250 r/min 37℃过夜培养；于1 L的LB液体培养基(卡那抗性)中接入1%的过夜培养菌，250 r/min 37℃培养3 h，然后加入0.5 mmol/L的IPTG在37℃条件下诱导6 h；收集菌体，超声破碎(300 W，超声10 s，间隙10 s为一次)30次，4℃ 12 000 r/min离心15 min；沉淀用8 mol/L的尿素充分溶解，上样于预先平衡好的NTA纯化柱(3 mL NTA介质，10倍柱体积NTA-0缓冲液平衡)进行纯化；使用10个柱体积的NTA-0缓冲液洗柱后，依次使用1个柱体积的NTA-X缓冲液(50 mmol/L PBS,pH 7.4,0.15 mol/L NaCl以及10,20,50,200和500 mmol/L咪唑)进行洗脱，分步收集不同组分并进行SDS-PAGE电泳检测，最终收集含目的蛋白的组分。

1.7 多克隆抗体的制备及效价测定

用1.6节纯化的融合蛋白作为抗原免疫6周大小的新西兰大白兔，初次免疫的抗原剂量为300 μg/只，后续3 次免疫每次为100 μg/只，免疫周期为20 d，免疫完后7-10 d取血(包括中途测试取血和最终放血)；第4 次免疫1周后从兔子耳缘静脉取血，利用间接ELISA法检测抗血清的效价；当效价检测合格后，从兔子的颈动脉取血，于-20℃条件下保存。

1.8 抗体特异性检测

取琥珀蚕丝腺50 g左右于预冷的研钵充分研磨至粉末状，加入1 mL水化液(8 mol/L尿素，2% CHAPS，1% Destreak Reagent)继续研磨样品至呈匀浆液，将匀浆液转移至1.5 mL EP管中，冰上裂解30 min,4℃ 12 000 g离心15 min，取上清液；得到的上清再在冰上裂解30 min，离心取上清，上清即琥珀蚕丝腺蛋白样品，样品用Bradford法测定蛋白浓度后于-20℃保存备用。利用12%的SDS-PAGE胶进行电泳，电泳后转PVDF膜，用3%的封闭液室温封闭1 h；用1∶1 000(v/v)稀释的多克隆抗体，4℃孵育过夜，用PBST缓冲液洗3次，每次8 min；用二抗HRP(1∶2 000,v/v)标记的山羊抗兔IgG室温孵育1 h，后用PBST洗3次；按照超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术)操作说明进行显色，随后进行化学发光成像系统(Tanon-5200Multi)检测。

1.9 免疫荧光观察

将解剖的琥珀蚕蚁蚕的丝腺和表皮及4龄幼虫丝腺组织(每头蚕为一样品，每组织共3个样品重复)放入1×PBS缓冲液中冲洗；然后转移到2 mL多聚甲醛固定液中，冰上静置30 min；弃固定液，加入2 mL免疫组化通透液，室温静置20 min提高细胞通透性；吸去通透液，加入2 mL封闭液，室温旋转孵育2 h，去除封闭液；加入1 mL按体积比1∶1 000稀释的AaSGF-1抗体，4℃旋转孵育过夜，用封闭液冲洗组织后，再加入封闭液旋转漂洗3次，每次15 min；加入1 mL cy3标记的山羊抗免IgG抗体(二抗，用二抗稀释液按体积比1∶5 000稀释)，室温避光旋转孵育2 h，加入封闭液冲洗组织1次；加入DAPI室温避光旋转孵育30 min，去除DAPI后用封闭液冲洗2次，再用封闭液避光旋转漂洗3次，每次15 min；在载玻片上滴加适量抗荧光猝灭剂，将各组织均匀展开于抗荧光猝灭剂中，盖上盖玻片在倒置荧光显微镜(OLYMPUS IX73)下观察。

2 结果

2.1 琥珀蚕AaSGF-1基因的克隆及序列分析

PCR扩增获得一条大小为1 050 bp的完整ORF序列(图1)，GC碱基含量为51.8%，编码349个氨基酸残基(图2)，利用3′和5′特异性引物进行RACE扩增全长cDNA序列，得到AaSGF-1基因60 bp的5′非编码区域的基因信息，GenBank登录号为MK889510.1。通过Compute pI/Mw对目的基因所编码的蛋白质的分子质量与等电点进行预测，其蛋白质分子质量为38.8 kD，理论等电点(pI)8.74。SMART软件分析显示SGF-1含有1个Forkhead结构域(第111-201位氨基酸)和一个HNF-C结构域(第297-347位氨基酸)，无跨膜结构域(图2)。利用PSIpred软件在线预测目的蛋白的二级结构，结果显示AaSGF-1中N末端(第1-116位氨基酸)和C末端(第199-349位氨基酸)的氨基酸残基都处于无规则卷曲状态，其他部分(第117-198位氨基酸)形成4个α螺旋(helix)和2个延伸链(extended strand)。

图1 琥珀蚕AaSGF-1基因的PCR扩增产物的电泳图谱Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification product of AaSGF-1 of Antheraea assamaM:DNA分子量标准DNA molecular weight marker;1:PCR产物PCR product.

图2 琥珀蚕AaSGF-1基因的核苷酸和推导的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AaSGF-1 gene of Antheraea assama方框内为起始密码子和终止密码子，阴影部分为Forkhead结构域，下划线为HNF-C结构域。Letters inside box were the initiation codon and stop codon.The sequence in gray background represents Forkhead domain.The underline stands for the HNF-C domain.

2.2 AaSGF-1的氨基酸序列特征与系统进化分析

对琥珀蚕AaSGF-1及其他物种SGF-1及FKH的氨基酸序列进行比对分析，结果表明琥珀蚕AaSGF-1的Forkhead结构域序列与家蚕Bombyxmori、帝王斑蝶Danausplexippus、斜纹夜蛾Spodopteralitura和菜青虫Pierisrapae的SGF-1蛋白的Forkhead结构域相似性达到100%，氨基酸序列一致性也都在90%以上。系统进化树(图3)结果表明，AaSGF-1与同属鳞翅目昆虫的家蚕、斜纹夜蛾、菜青虫、帝王斑蝶及避债蛾的SGF-1蛋白亲缘关系较近，聚在一个支上，但与其他的非脊椎动物及哺乳动物的遗传距离较远。

2.3 AaSGF-1基因在幼虫不同组织中的表达情况

qPCR检测AaSGF-1在琥珀蚕5龄第4天幼虫不同组织的表达结果如图4(A)所示，AaSGF-1在丝腺组织中高量表达，在其他组织中几乎不表达。从丝腺不同部位的表达情况(图4:B)来看，AaSGF-1在前部丝腺中几乎不表达，而主要表达于中部和后部丝腺，尤其在后部丝腺中表达量最高。

图4 qPCR检测AaSGF-1在琥珀蚕5龄幼虫不同组织(A)和丝腺不同部位(B)中的表达量Fig.4 Expression levels of AaSGF-1 in various tissues (A) and different parts of silk gland (B) of the 5th instar larvae of Antheraea assama detected by qPCRHe:头Head;Mg:中肠Midgut;Sg:丝腺Silk gland;He:血液Hemolymph;Cu:表皮Cuticle;Fb:脂肪体 Fat body;ASG:前部丝腺Anterior silk gland;MSG:中部丝腺Middle silk gland;PSG:后部丝腺Posterior silk gland.

2.4 AaSGF-1的原核表达与蛋白纯化

基于pET-28a(+)载体构建获得琥珀蚕AaSGF-1基因重组表达质粒。用BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切AaSGF-1/pET-28a(+)重组表达质粒，琼脂糖凝胶电泳显示，重组质粒经双酶切后得到的目的片段与预期大小一致(图5:A)，且基因测序证实载体构建成功。将阳性表达质粒AaSGF-1/pET-28a(+)转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株后用0.5 mmol/L的IPTG在37℃下诱导4 h，收集菌体进行超声破碎，分别取上清与沉淀经15% SDS-PAGE电泳检测，结果显示上清与沉淀中都有大小与目的蛋白相近的条带，说明AaSGF-1蛋白以可溶的形式和包涵体的形式表达(图5:B)。

图5 AaSGF-1/pET-28a(+)表达载体鉴定(A)、及重组蛋白表达(B)和蛋白纯化(C)的SDS-PAGE检测Fig.5 Identification of the expression vector AaSGF-1/pET-28a(+) (A),and SDS-PAGE detection of expression of the recombinant protein (B) and protein purification (C)M1:DNA分子量标准DNA molecular weight marker;1:重组质粒Recombinant plasmid;2:质粒酶切产物Enzyme digest of recombinant plasmid;3:AaSGF-1的PCR扩增产物PCR product of AaSGF-1;M2:蛋白质分子量标准Protein molecular weight marker;4:总菌体裂解液(未诱导)Total bacterial lysate (not induced);5:经过37℃ 0.5 mmol/L IPTG诱导4 h后的总菌体裂解液Total bacterial lyasate induced by 0.5 mmol/L IPTG at 37℃ for 4 h;6:超声上清Ultrasonic supernatant;7:超声沉淀Ultrasonic precipitation;8:超声沉淀用尿素溶解液(未纯化)Urea dissolution under ultrasonic precipitation (unpurified);9:流穿液Flow-through sample;10-14:分别用浓度为10,20,50,200和500 mmol/L的咪唑洗脱获得的蛋白The protein sample washed with 10,20,50,200 and 500 mmol/L imidazole elution buffer,respectively.

经检测AaSGF-1蛋白能以可溶形式和包涵体形式表达，但可溶形式表达的蛋白未获较好纯化效果，所以用包涵体形式表达的蛋白进行纯化制备抗体。目的蛋白在变性条件下与Ni-NTA柱结合效果较好，在50～500 mmol/L咪唑处可洗脱获得目的蛋白(图5:C)，收集纯化度高的目的蛋白，用BSA标准品测定目的蛋白的浓度为0.8 mg/mL，达到制备多克隆抗体的要求。

2.5 AaSGF-1的多克隆抗体的效价及特异性检测

利用原核表达的琥珀蚕AaSGF-1的包涵体形式制备多克隆抗体。重组蛋白的抗体效价检测结果显示，Anti-AaSGF-1多克隆抗体的效价比较高，符合抗体效价要求，且抗体最优稀释浓度应控制在1∶15 000之内。以pET-28a(+)质粒菌表达蛋白及AaSGF-1/pET-28a(+)质粒菌表达蛋白为抗原，Anti-His为一抗,以琥珀蚕丝腺蛋白及原核表达纯化的His-AaSGF-1融合蛋白为抗原，Anti-AaSGF-1多克隆抗体为一抗进行Western blot检测，结果表明制备的多克隆抗体可与目的蛋白AaSGF-1结合，在理论位置处出现明显的杂交条带，而阴性对照组(免疫前血清)不发生反应(图6:B)，且Anti-His可以和AaSGF-1/pET-28a(+)质粒菌表达蛋白结合而与pET-28a(+)质粒菌表达蛋白不反应(图6:A)。结果说明制备的Anti-AaSGF-1多克隆抗体具有良好的特异性，抗体制备成功。

图6 Western blot检测His标签抗体(A)和Anti-AaSGF-1多克隆抗体(B)的特异性Fig.6 Specifcity of His-tag antibody (A) and polyclonal antibody Anti-AaSGF-1 (B) detected by Western blot1:pET-28a(+)质粒菌表达蛋白Expressed protein from bacteria containing plasmid pET-28a(+);2:AaSGF-1/pET-28a(+)质粒菌表达蛋白Expressed protein from bacteria containing recombinant plasmid AaSGF-1/pET-28a(+);3:免疫前血清(阴性对照)Pre-immune serum as the negative control;4:琥珀蚕丝腺蛋白Silk protein of Antheraea assama;5:融合蛋白His-AaSGF-1 Fusion protein His-AaSGF-1.

2.6 AaSGF-1表达的免疫荧光分析

免疫萤光观察结果如图7所示，琥珀蚕蚁蚕丝腺及4龄幼虫的丝腺经Anti-AaSGF-1多克隆抗体染色后，可以观察到红色荧光，并能与经过DAPI染色的细胞核区域完全重合，但蚁蚕表皮经Anti-AaSGF-1多克隆抗体染色后观察不到红色荧光。这一结果表明AaSGF-1蛋白在琥珀蚕蚁蚕丝腺及4龄幼虫的丝腺中有表达，而在蚁蚕表皮中不表达。

图7 琥珀蚕AaSGF-1的免疫荧光分析结果Fig.7 Immunofluorescence results of AaSGF-1 of Antheraea assamaA-C:蚁蚕丝腺Silk gland of the newly hatched larva;D-F:蚁蚕中部丝腺Middle silk gland of the newly hatched larva;G-I:4龄幼虫中部丝腺Middle silk gland of the 4th instar larva;J-L:蚁蚕表皮Cuticle of the newly hatched larva.DAPI:以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐染色Stained with 2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride;AaSGF-1:以Anti-AaSGF-1多克隆抗体染色Stained with polyclonal antibody Anti-AaSGF-1;Merge:前两图的合并Merge of the former two pictures.

3 讨论

Fox蛋白在果蝇中研究的最为深入，果蝇FKH蛋白在胚胎唾液腺的发育过程中起着至关重要的作用，不仅促进唾液腺形成早期分泌细胞的形成(Myat and Andrew,2000)，还能够阻遏唾液腺细胞凋亡，提高唾液腺细胞分泌功能，维持唾液腺的正常生理状态(Abramsetal.,2006)。家蚕丝腺和果蝇的唾液腺是同源的器官，具有相似的发育调控机制。家蚕SGF-1蛋白包含有保守的Forkhead结构域，与果蝇FKH蛋白同源。研究发现，家蚕SGF-1能与Ser-1基因启动子区域的SA位点结合并激活Ser-1基因转录(Weigeletal.,1989)，还可以与丝素重链fib-H基因的SA和SB位点结合，调控fib-H基因的表达，并在fib-L和P25基因中同样鉴定到了SGF-1可能的结合位点(Huietal.,1990)。进一步的实验证实，SGF-1参与后部丝腺细胞中P25基因的时空表达调控(Julienetal.,2002)，可以与转录因子Bmsage结合共同调控fib-H的转录(Zhaoetal.,2014)。另有研究结果表明，PI3K/AKT/TORC1信号通路抑制剂处理可降低家蚕幼虫后部丝腺中SGF-1的表达，进而调控丝素蛋白的合成(郭亚新等,2017)。除此之外，Kokubo等(1996)用原位杂交和免疫组化的方法发现SGF-1可能参与了家蚕胚胎期肠道、丝腺和中枢神经系统等器官的发育。

本研究对琥珀蚕的AaSGF-1基因进行初步研究，通过克隆成功获得琥珀蚕AaSGF-1的全长cDNA序列，生物信息学分析显示琥珀蚕AaSGF-1蛋白包含有Fox家族典型的Forkhead结构域(图2)，且与家蚕Forkhead蛋白结构具有高度保守性。另外，免疫荧光结果显示AaSGF-1在蚁蚕丝腺中有表达(图7)，暗示AaSGF-1蛋白可能在琥珀蚕丝腺发育过程中具有重要的生物学功能。组织表达结果表明，AaSGF-1在丝腺组织中大量表达而在其他组织中几乎不表达(图4)，且抗体染色结果表明AaSGF-1在丝腺组织中有蛋白水平上的表达(图7)，推测琥珀蚕AaSGF-1可能参与琥珀蚕丝蛋白的合成与分泌。然而，琥珀蚕属大蚕蛾科的绢丝昆虫除生活习性、饲料、滞育性等与家蚕存在差异外，丝蛋白编码基因与家蚕也不同，家蚕丝蛋白主要由丝素蛋白和丝胶蛋白构成，丝素蛋白由fib-H(350 kD)、fib-L(26 kD)和P25蛋白(fibrohexamerin,27/30 kD)按照6∶6∶1比例构成(Inoueetal.,2000)。大蚕蛾科的丝素蛋白只由fib-H构成，不含fib-L及P25蛋白(Adarshetal.,2015)。Dong等(2015)对包括琥珀蚕在内的6种大蚕蛾非桑蚕的丝腺进行转录组测序分析，结果只在蓖麻蚕丝腺中发现P25的同源体，而fib-L在6种大蚕蛾非桑蚕的幼虫丝腺中都没有被发现。所以有关AaSGF-1调控琥珀蚕丝蛋白基因表达以及如何参与琥珀蚕丝腺发育的分子机制，有待进一步的研究。