大鼠血栓闭塞性脉管炎模型建立及靶向抑制NF-κB通路对TAO大鼠病变过程的影响

田 野 唐忠尉 张 磊 胡 阳 李新喜

1新疆医科大学第一附属医院血管外科，新疆 乌鲁木齐 830000

2新疆医科大学第一附属医院泌尿外科，新疆 乌鲁木齐 830000

血栓闭塞性脉管炎（thromboangiitis obliterans，TAO）是一种以非动脉硬化性、炎性、血栓性、闭塞性和非化脓性血管受累为病理特征的周围血管疾病，多为四肢中、小动静脉受累，临床表现为肢体缺血、疼痛、间歇性跛行、血栓性静脉炎，常发生于35～50岁的男性患者[1-2]。传统治疗及药物治疗TAO的临床效果不佳，并具有较高的复发率及截肢率[3]。目前，研究显示TAO的发生与吸烟密切相关，但其发病机制仍尚未清晰[4]。目前TAO发生机制的研究主要集中于炎性反应及免疫应答的调控。炎性反应贯穿TAO的整个过程，可损伤血管内皮、聚集并导致血栓形成[5]。有研究发现，刺激血管内皮细胞的Toll样受体-4（Toll-like receptor 4，TLR-4）后，可启动髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88），从而激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），最终导致大量炎性因子释放[6-7]。而且“炎性反应学说”已成为TAO发病机制的主流学说，进一步研究TAO炎性反应信号通路或其关键的信号转导分子，对从炎性反应角度干预TAO病变过程具有重要价值。同时，建立TAO病理特点的动物模型，对于探索该病的发病机制及治疗药物的研发具有重要的意义。手术结合化学造模法是通过手术经股动脉注射月桂酸钠，利用月桂酸钠对血管内皮细胞的损伤诱导血栓形成，从而建立TAO大鼠模型。因此，本研究以大鼠为实验动物，应用手术结合化学造模法建立TAO动物模型，同时探讨靶向抑制NF-κB通路对TAO大鼠病变过程的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用60只SPF级Wistar雄性大鼠（IACUC201902-15），平均体重（350±50）g。实验动物饲养于新疆医科大学实验动物中心，饲养环境温度（22±2）℃，可自由进食、进水，饲养室每隔12 h明暗交替。本研究获得新疆医科大学第一附属医院动物实验医学伦理委员会批准，实验动物购于新疆医科大学实验动物中心。

1.2 材料及仪器

生理盐水（上海源叶生物科技有限公司，R21479）、10%水合氯醛（上海源叶生物科技有限公司，R21477）、青霉素（索莱宝，A8180）、月桂酸钠（上海源叶生物科技有限公司，S30244）、NF-κB抑制剂（pyrrolidinedithiocarbamate ammonium，PDTC；AbMole，M4005）、10%甲醛（索莱宝，G2161）、脱蜡液（索莱宝，YA0031）、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）（索莱宝，P1010）、苏木素（索莱宝，BL700B）、树胶（索莱宝，G8590）、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，AR1180）、隔水式恒温培养箱（上海博迅实业有限公司，B6-270）、烘干箱（上海博迅实业有限公司，BXH-280）、漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，GL-88B）、离心机（精骐，MLX-206）、光学显微镜（Leica Microsystems Ltd，DM4000）。

1.3 实验动物分组及标本采集

根据随机数字表法分为六组，各10只。（1）正常对照组，大鼠正常饲养，不做任何处理；（2）模型组，大鼠进行TAO模型构建，术后第2天开始进行腹腔注射生理盐水，100 mg/（kg·d），连续注射21 d后进行取材；（3）假手术组，大鼠进行手术时不给月硅酸溶液，注入等量生理盐水，然后术后第2天开始进行腹腔注射生理盐水，100 mg/（kg·d），连续注射21 d后进行取材；（4）NF-κB抑制7 d组，大鼠造模成功后第2天开始腹腔注射PDTC，100 mg/（kg·d），给药7 d后取材；（5）NF-κB抑制14 d组，给药开始时间及剂量同NF-κB抑制7 d组，给药14 d后取材；（6）NF-κB抑制21 d组，给药开始时间及剂量同NF-κB抑制7 d组，给药21 d后取材。

1.4 TAO模型构建

TAO大鼠模型建立前，禁食12 h，取大鼠右后肢进行造模。腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg），以腹股沟中点切开1.5 cm切口，钝性分离皮下组织与肌肉组织，暴露股动脉鞘，游离腹壁浅动脉上段股动脉，长度0.5 cm，近心端用动脉夹阻断血流，向远心端注入0.1 ml月桂酸钠溶液（10 g/L）后脱脂棉球按压穿刺点止血。15 min后检查无活动性出血即缝合皮肤。手术完毕后给予青霉素40万单位腹腔注射，预防感染。造模后，大鼠右后肢出现缺血表现，如皮肤苍白青紫、皮肤温度降低、坏疽、溃烂、坏死等，则表明造模成功。

1.5 观察指标及检测方法

通过HE染色观察六组大鼠右后肢动脉血管组织病理学变化，将六组大鼠右后肢动脉血管10%甲醛浸泡7 d以固定，然后进行常规的石蜡包埋固定后进行切片，厚度4～8 μm。将切片放于二甲苯中，充分浸泡10 min，浸泡完后更换二甲苯继续浸泡10 min，将浸泡过二甲苯的切片先放入无水乙醇中浸泡5 min，再依次置于95%、85%、70%乙醇中各浸泡5 min。将水化后的切片使用PBS浸泡清洗，每次浸泡5 min，共3次，清洗后行苏木素染色，每组大鼠组织切片滴加100 μl苏木素，染色10 min。再使用1%的盐酸乙醇使苏木素染色的组织切片返蓝，让细胞核染蓝色。返蓝结束后先用清水进行清洗，再用双蒸水将组织切片冲洗干净。然后再滴加伊红染液使组织染色3 min后，80%乙醇脱水5 s，95%乙醇脱水2 min，无水乙醇脱水2 min。将脱水后的组织切片使用二甲苯浸泡2次，每次4 min，然后晾干组织切片并使用中性树胶封片。

1.6 统计学方法

应用R-X-64-4.0.3的R程序软件包进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以n表示；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 六组大鼠取材时体重比较

取材时，对照组大鼠体重（346.0±25.5）g，模型组大鼠体重（356.4±23.0）g，假手术组大鼠体重（353.9±25.5）g，NF-κB抑制7 d组大鼠体重（350.3±23.9）g，NF-κB抑制14 d组大鼠体重（354.2±24.3）g，NF-κB抑制21 d组大鼠体重（351.6±26.2）g，六组大鼠体重比较，差异无统计学意义（F＝0.218，P＝0.953）。

2.2 造模情况

造模（模型组、NF-κB抑制7 d组、NF-κB抑制14 d组、NF-κB抑制21 d组）大鼠均成功，技术成功率100%，无大鼠死亡。造模前，大鼠右后肢毛色柔顺、足爪部正常；造模时，当大鼠注射月桂酸钠溶液15 min后，皮肤苍白、皮肤温度降低；造模后第2天，大鼠右后肢足爪部呈不同程度的青紫色、肿胀，患肢均有缺血表现；严重者足趾变黑，并逐渐向上发展成坏疽。造模3～5 d后，病变进一步加剧，造模大鼠患肢处出现溃烂、渗液、恶臭味，部分坏疽有脱落，部分大鼠呈现腹胀、拒动、消瘦、少食等症状。模型组大鼠右后肢肌肉群出现不同程度坏死，多为干酪样，伴有感染、恶臭味；远端肢体呈干性坏疽，木乃伊化，部分脱落，右后肢可见骨骼外露，虽然部分造模大鼠右后肢外形完整无坏疽，仅呈跛行和拖拽状，但解剖后其后肢仍有肌肉坏死。各NF-κB抑制组大鼠右后肢有不同程度的改善。（图1）

2.3 右后肢动脉血管组织变化

对照组大鼠右后肢动脉血管无明显变化；假手术组大鼠右后肢动脉血管周边有少量炎性反应；模型组大鼠右后肢动脉血管腔内有血栓形成并且机化，血管周边纤维组织增生伴炎性反应；NF-κB抑制7 d大鼠右后肢动脉血管腔内有机化血栓，周边炎性肉芽组织增生，组织间有出血；NF-κB抑制14 d组大鼠右后肢动脉壁增厚，周围有炎性纤维组织增生伴炎性反应，血管腔内有炎性纤维组织增生；NF-κB抑制21 d组大鼠右后肢动脉血管周边纤维组织增生，有炎性反应并有炎性肉芽组织。（图2、图3）

图2 六组大鼠右后肢动脉血管组织变化情况

图3 大鼠右后肢动脉血管HE染色（×100）

3 讨论

TAO是一种以中小动脉和静脉节段性闭塞为特征的疾病，主要涉及四肢的血管[8]。目前，吸烟、寒冷和感染等因素被认为与TAO发展有关，但该病的确切发病机制目前仍不清晰[9]。非化脓性炎性反应是TAO的病理特征，即炎性反应过度激活和免疫反应紊乱，导致多种细胞因子大量分泌使血管内皮浸润，破坏内皮完整性进而形成血栓导致血管闭塞[10]。早期治疗TAO具有明显的临床疗效，治疗方式包括防治下肢血栓、控制及治疗缺血性疼痛等[3]。TAO主要发生在年轻人群中并有较高的截肢率[11]。因此，一旦确诊TAO应及时治疗，以改善肢体缺血的症状，防止因坏死而截肢，从而影响生活质量[12]。

目前制作TAO模型的方法：（1）损伤动脉内膜法，即损伤血管内膜使血小板聚集形成血栓；（2）注入凝血酶法，向血管内注入药物，使血液黏稠，易于凝固形成血栓；（3）向血管内填充血凝块堵塞管腔，诱导血栓形成。注入凝血酶法或损伤动脉内膜法为经典的血栓模型制备法，注入凝血酶法虽然方法简单，但形成的血栓结构松散，不符合人体自发性血栓形成的组织学特征；而损伤动脉内膜法操作困难，成本高，不易用于大量造模。本实验采用股动脉注射月桂酸钠的方法建立TAO大鼠模型，通过参考判定标准，经股动脉注射月桂酸钠可以成功建立TAO大鼠模型，方法简便有效，模型稳定，可用于TAO病理变化及药物研制等研究[13]。

本研究模型组大鼠HE染色显示，右后肢动脉血管腔内有血栓形成，血管周围有纤维组织增生。这是由于炎性反应的过度激活及免疫应答的紊乱对血管内皮功能造成损伤，引起血小板在内皮损伤的部位发生激活、聚集，并促进血栓形成。而随着NF-κB抑制组的抑制时间增加，HE染色显示炎性纤维组织增生和血管组织周围的炎性肉芽增生，而无血栓形成，表明随着NF-κB抑制剂的作用可以抑制炎性反应，阻止TAO的病情发展，其机制是由于抑制核因子κB抑制因子α的磷酸化、阻止NF-κB易位入核并减少下游细胞因子的表达。NF-κB是调节炎性反应和免疫反应的关键转录因子，是多种机体信号通路的启动因子[14]。随着NF-κB的抑制，其阻止TAO病情发展的具体下游信号通路尚不清楚，因为本研究缺少炎性因子、相关蛋白的检测，无法明确延缓TAO病情发展的具体NF-κB信号通路。因此，NF-κB信号通路对TAO发生、发展的机制仍需进一步探索及研究。

本研究通过手术结合化学造模法制作了一种简单、可重复性高的大鼠TAO模型，并用该模型初步证实靶向抑制NF-κB通路可阻止TAO病情发展。