响应面法优化节瓜中丙醇二酸提取条件的研究

刘 娜,杜 旋,鲁 博,田守波,李 丹

(1 上海市农业科学院设施园艺研究所,上海市设施园艺技术重点实验室,上海201403;2 上海市农业科学院农业科技信息研究所,上海201403;3 上海市奉贤区农业技术推广中心,上海201611)

节瓜(Benincasa hispidaCogn.var.Chieh-qua How.)是葫芦科冬瓜属的一个变种,别名毛节瓜、北瓜、毛瓜,原产于我国华南地区,具有悠久的栽培历史,是我国传统的药食兼用型特色蔬菜品种[1-2]。节瓜具有清热解毒、利尿消肿、美容养颜的作用,对治疗肾病、糖尿病等也有一定的辅助效果[3-4]。节瓜果实中富含蛋白质、碳水化合物、粗纤维、钙、磷、铁、维生素A、维生素C、维生素B1、维生素B2、有机酸等营养成分,其中丙醇二酸是一种重要的活性成分[5-6]。丙醇二酸是一种小分子有机酸,又名羟丙二酸,可抑制人体内糖类转化为脂肪,阻止体内脂肪堆积,但不妨碍糖类物质向人体提供热量和能量[7-9]。人体自身不能合成丙醇二酸,一般通过饮食获得。研究发现,只有黄瓜、冬瓜、节瓜等极少数果蔬中含有该物质,其是植物有机型丙醇二酸的重要来源[10-12]。近年来,随着生活水平的不断提高,人们的健康意识逐渐增强,越来越注重节瓜在美容、减肥方面的作用,节瓜的需求量逐年增加[13-15]。丙醇二酸含量是衡量节瓜营养品质的一个重要指标[8]。如何从节瓜果实中快速、高效地提取丙醇二酸是定量分析其含量的关键环节,也是进一步开发利用节瓜的前提。

迄今,国内外针对节瓜的研究报道大多在引种栽培、营养价值、抗病性以及遗传分析等方面,关于丙醇二酸的研究主要集中在高含量种质资源筛选、配合力分析等方面,而关于丙醇二酸提取条件方面的报道比较少见[16-19]。前人采用单因素和正交试验法对丙醇二酸的提取工艺进行过一些研究[20-21]。徐立俐等[21]发现,乙醇浓度、料液比、萃取时间、萃取温度等参数可以影响丙醇二酸的提取效果,影响大小顺序为提取时间、料液比、萃取温度、乙醇浓度;并通过单因素和正交试验法优化得到了黄瓜中丙醇二酸的最佳提取条件。目前,关于节瓜中丙醇二酸的提取条件还未见报道。

响应面分析法(Response surface methodology,RSM)是利用合理的试验设计并通过试验得到一定数据,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析寻求最优工艺参数,解决多变量问题的一种统计方法,已在植物黄酮类、糖类、酚类等物质提取上广泛应用[22-25]。本试验利用单因素试验及响应面法对节瓜果实中丙醇二酸的提取方法进行优化,确定最佳提取条件,以期为得到更简便、精确的提取方式奠定基础,并为进一步开发利用节瓜中丙醇二酸提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择广东地方节瓜品种‘J-31’为试验材料,该品种为短圆柱形瓜,瓜皮绿色,瓜肉浅绿。试材种植于上海市农业科学院庄行综合试验站大棚内,株距35 cm,行距60 cm,随机排列,3 次重复,每重复种植10 株,统一标准田间管理。

1.2 丙醇二酸的提取与测定

节瓜果实中丙醇二酸含量的测定采用高效液相色谱法(HPLC)。丙醇二酸标准品购自美国Alfa Aesar 公司,纯度98%。在授粉后20 d,每重复分别摘取嫩瓜1个,1 h 内转移至实验室,用榨汁机榨成糊状,装入袋中,分别标记后于-20 ℃保存备用。检测时,取少量糊状物于研钵中研磨,然后装入1.5 mL 离心管中,称质量,12000 r∕min 离心3 min,取上清液过滤(滤膜0.45 μm),取滤液进行检测。每个处理重复3 次。高效液相色谱仪为DGU-20A3(日本岛津化学实验仪器厂);色谱检测仪器为紫外检测器;流动相为硫酸钠溶液;流速1.0 mL∕min;进样量10 μL。

1.3 单因素试验

1.3.1 乙醇浓度的筛选

样品分别用体积分数(下称乙醇浓度)为0、15%、30%、45%、60%的乙醇于料液比(样品∶乙醇)1∶60(g∕mL)、25 ℃条件下提取60 min 后,测定丙醇二酸含量,筛选最佳乙醇浓度。

1.3.2 料液比的筛选

样品分别以1∶30、1∶45、1∶60、1∶75、1∶90 的料液比(g∕mL)在乙醇浓度15%、25 ℃条件下提取60 min后,测定丙醇二酸含量,筛选最佳料液比。

1.3.3 萃取时间的筛选

样品分别浸提30 min、45 min、60 min、75 min、90 min 后于料液比1∶60(g∕mL)、乙醇浓度15%、25 ℃条件下提取,测定丙醇二酸含量,筛选最佳萃取时间。

1.3.4 萃取温度的筛选

样品分别在5 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃温度条件下于料液比1∶60(g∕mL)、乙醇浓度15%中萃取60 min 后,测定丙醇二酸含量,筛选最佳萃取温度。

1.4 响应面法试验因素设计

以单因素试验结果为基础,运用Box-Benhnken 试验设计原理,采用乙醇浓度、料液比、萃取时间和萃取温度4个因子3个水平试验设计(表1)对节瓜丙醇二酸提取条件进行优化。

表1 Box-Benhnken 响应面法试验因素与水平Table 1 Test factors and levels of Box-Behnken response surface method

1.5 数据处理与分析

采用Design-Expert 8.0 软件进行数据处理,采用Origin 8.5 软件进行绘图。当P＜0.05 时,差异达到显著水平;当P＜0.01 时,差异达到极显著水平。

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析

2.1.1 乙醇浓度对丙醇二酸提取的影响

由图1 可见,当乙醇浓度为15%时,丙醇二酸的提取值最高;当乙醇浓度为60%时,丙醇二酸提取值最低。其原因可能是随着乙醇浓度继续增加,样品中脂溶性成分和一些小分子物质溶出,影响了丙醇二酸的提取,导致丙醇二酸提取值降低。

2.1.2 料液比对丙醇二酸提取的影响

由图2 可见,当料液比为1∶45(g∕mL)时,丙醇二酸提取值最高;随着料液比继续增大,丙醇二酸提取值下降,当料液比为1∶90(g∕mL)时,丙醇二酸提取值降到最低。因此,料液比以1∶45(g∕mL)左右为宜。

图1 乙醇浓度对丙醇二酸提取值的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration on the extraction value of tartronic acid

图2 料液比对丙醇二酸提取值的影响Fig.2 Effects of material-liquid ratio on the extraction value of tartronic acid

2.1.3 萃取时间对丙醇二酸提取的影响

由图3 可见,随着萃取时间增加,丙醇二酸的提取值呈先升高后降低的变化趋势。当萃取时间为60 min时,丙醇二酸提取值最高。因此,萃取时间以60 min 为宜。

2.1.4 萃取温度对丙醇二酸提取的影响

由图4 可见,当萃取温度在5—25 ℃时,随着温度升高,溶剂与样品之间的平均动能增加,促进了溶剂与丙醇二酸的接触,丙醇二酸提取值逐渐升高;当温度超过25 ℃时,提取值逐渐下降,这可能是由于温度升高,丙醇二酸分解加快或者与其他物质反应,影响了提取效果。因此,萃取温度以25 ℃左右为宜。

2.2 响应面法试验分析

2.2.1 因子与水平的选取及分析

以单因素试验结果为基础,运用Box-Benhnken 试验设计原理对节瓜中丙醇二酸的提取条件进行优化,通过响应面设计,得到丙醇二酸提取值(表2)。

图3 萃取时间对丙醇二酸提取值的影响Fig.3 Effects of extraction time on the extraction value of tartronic acid

图4 萃取温度对丙醇二酸提取值的影响Fig.4 Effects of extraction temperature on the extraction value of tartronic acid

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

2.2.2 回归模型的建立及分析

根据试验结果,以丙醇二酸提取值(I)为响应值,乙醇浓度(A)、料液比(B)、萃取时间(C)和萃取温度(D)为自变量拟合得到四元二次回归模型:I=29.04 -5.61A -1.58B -0.91C -0.22D +2.68AB +2.84AC-1.45AD-0.18BC-0.19BD+0.22CD+1.18A2-7.77B2-9.45C2-6.09D2。

由表3 可知,该回归模型极显著(F=11.14,P＜0.0001),表明建立的模型具有意义;失拟项不显著(F=1.05,P=0.1557),表明该模型受其他因素影响较小,拟合度较好;相关系数R2=0.9891,说明真实值与该模型的预测值具有较高的相关性。各因素对提取效果影响程度依次为:乙醇浓度(A) ＞料液比(B) ＞萃取时间(C) ＞萃取温度(D)。料液比(B)影响显著(P=0.00265),乙醇浓度(A)(P＜0.0001)、料液比的二次项(B2)(P=0.0002)、萃取时间的二次项(C2)(P＜0.0001)、萃取温度的二次项(D2)(P=0.0003)影响极显著。

乙醇浓度(A)、料液比(B)、萃取时间(C)和萃取温度(D)4个因素中任意2个因素取零水平时,其余2个因素相互作用对丙醇二酸提取效果的影响见图5—10。各因素间的交互作用对丙醇二酸提取效果影响的显著性可以从响应面曲线的坡度和等高线的形状得到。乙醇浓度和萃取时间相互作用的响应面曲线最陡,等高线最扁(图6),说明乙醇浓度和萃取时间对丙醇二酸提取效果的交互作用最为显著;同理可得,各因素之间的交互作用对节瓜中丙醇二酸提取效果的影响顺序为AC ＞AB ＞BC ＞AC ＞BD ＞AB。

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

图5 乙醇浓度和料液比对丙醇二酸提取值影响的等高线图和曲面图Fig.5 Contour map and curved surface map of the effects of ethanol concentration and material-liquid ratio on the extraction value of tartronic acid

图6 萃取时间和乙醇浓度对丙醇二酸提取值影响的等高线图和曲面图Fig.6 Contour map and curved surface map of the effects of extraction time and ethanol concentration on the extraction value of tartronic acid

图7 萃取温度和乙醇浓度对丙醇二酸提取值影响的等高线图和曲面图Fig.7 Contour map and curved surface map of the effects of extraction temperature and ethanol concentration on the extraction value of tartronic acid

图8 萃取时间和料液比对丙醇二酸提取值影响的等高线图和曲面图Fig.8 Contour map and curved surface map of the effects of extraction time and material-liquid ratio on the extraction value of tartronic acid

图10 萃取温度和萃取时间对丙醇二酸提取值影响的等高线图和曲面图Fig.10 Contour map and curved surface map of the effects of extraction temperature and extraction time on the extraction value of tartronic acid

2.2.3 最佳提取条件的确定和验证

由Design-Expert 8.0.6 软件分析得到的最大响应面值对应的最佳条件为:乙醇浓度2.69%、料液比1∶58.08(g∕mL)、萃取时间54.78 min、萃取温度24.03 ℃,在此条件下,丙醇二酸提取值最高,为34.87 mg∕kg。为检验该方法的可靠性,结合操作的便利性,将各提取条件修正为:乙醇浓度5%、料液比1∶60(g∕mL)、萃取时间55 min、萃取温度25 ℃。对修正后的提取条件进行3 次平行验证性试验,得到节瓜丙醇二酸提取值平均为34.26 mg∕kg,与模型预测值相比,相对误差为1.75%,说明该模型有效、可靠,与实际情况拟合良好,在实际操作中具有一定的参考价值。

3 结论与讨论

本试验以节瓜为材料,在单因素试验基础上,利用响应面法对节瓜中丙醇二酸提取工艺进行考察和优化,建立了四元二次回归模型,并分析了各因子对响应值的影响,结果表明:模型拟合可信度高,能较好地分析与预测节瓜中丙醇二酸的提取效果。因此,采用响应面法进行优化以得到最大提取率。

正交试验法和响应面法是目前常用的提取工艺优化方法。研究表明,与正交试验相比,响应面法可较好地解析各因素与响应值的关系,特别是各因素的互作效应,在一个连续区域内筛选最优方案,最终更好地优化提取工艺,这也是响应面法比正交法更能精确地优化提取条件的原因[26]。因此,对于影响因素较多、各因素间关系较复杂的工艺大都采用较精确的响应面法进行优化[27]。本研究筛选出节瓜中丙醇二酸最佳提取工艺为:乙醇浓度5%、料液比1∶60(g∕mL)、萃取时间55 min、萃取温度25 ℃,实际提取值(34.26 mg∕kg)与模型预测值(34.87 mg∕kg)相比,相对误差为1.75%,说明该模型有效、可靠。同时,也说明前期单因素试验设计中设置的乙醇浓度与响应面法预测的最佳提取条件中乙醇浓度有较大偏差。可见,单纯应用单因素试验法研究物质的提取条件有较大局限性。在黄瓜果实丙醇二酸提取条件的研究中[21],采用单因素和正交试验法得出最佳提取条件为:料液比1∶60(g∕mL)、乙醇浓度50%、萃取时间2 h、萃取温度35 ℃,与本研究得出的条件有所差别。这可能由于黄瓜和节瓜中其他物质种类和含量不同,导致在提取过程中对丙醇二酸的干扰程度不同,因此得到的提取工艺有差异。可见,同一种物质在不同作物间的提取条件不同,应根据具体作物有针对性地进行条件优化筛选。本研究可为进一步提高节瓜中丙醇二酸的提取和利用奠定基础。