通络益肾方对糖尿病肾病大鼠线粒体功能障碍的保护作用

李小会 ，贾国华，王 琦，雷根平，谷浩荣，陈丽名

（1.陕西中医药大学，陕西咸阳 712000；2.北京王府中西医结合医院肾病科，北京 102209；3.河南省灵宝市中医院，河南灵宝 472500；4.陕西中医药大学附属医院，陕西咸阳 712000）

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）以蛋白尿及肾功能受损为特征，是导致终末期肾衰竭的主要病因。足细胞受损是DN 蛋白尿的始发机制，线粒体功能障碍在DN足细胞损伤中起核心作用。DN 时活性氧（Reactive oxygen species，ROS）过量产生，出现氧化应激及炎症反应，最终累及足细胞线粒体［1］，启动并促进了DN 的发生发展。前期研究证实通络益肾方是治疗DN 的有效方剂［2-9］，本研究通过观察DN 大鼠足细胞线粒体功能的变化及通络益肾方的干预效果，以阐明该方的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级SD 大鼠，雄性，260 只，体质量（200±20）g，购自西安交通大学医学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（陕）2012—003。

1.2 试剂与药物 通络益肾方由生地、山萸肉、山药、茯苓、制附子、酒大黄、桃仁、全蝎、水蛭、泽泻组成。药材由陕西中医药大学附属医院提供，由陕西中医药大学中药鉴定教研室彭亮副教授鉴定为正品。大鼠用药剂量进行折算，加水煎煮2 次，质量浓度为2.38 g／mL。缬沙坦胶囊（北京诺华制药有限公司，批号X1870），制备成混悬液（1.44 mg／mL）；链脲佐菌素（美国Sigma 公司，STZ，批号X1966）；Trizol RNA 分离试剂盒（美国Invitrogen 公司，批号15596-026）；SYBR Mix、逆转录试剂盒（日本Takara公司，批号RR036 A、10102ES）；JC-10 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号CA1310）。

1.3 仪器 Tecai G2 Spirit 透射电镜（美国FEI 公司）；Lightcycler96 反应仪（法国Eppendorf 公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coulter 公司）；罗康血糖仪（德国罗氏有限公司）。

2 方法

2.1 建模 大鼠适应性喂养1 周，3%戊巴比妥钠（30 mg／kg）腹腔注射麻醉行右肾切除，1 周后 STZ 腹腔注射（45 mg／kg）；注射72 h 后，连续3 d 检测血糖，若血糖浓度≥16.7 mol／L 则为大鼠糖尿病形成；3 周后测24 h UPr≥30 mg／L，为DN 成模，此时为实验的开始，记为0 周。正常对照组予假手术，仅对皮肤和肌肉切开缝合，不切除肾脏，并注射枸橼酸缓冲液。期间正常对照组5 只大鼠死亡；DN 造模组不达标5 只、死亡4 只，剩余201 只。

2.2 分组及给药 大鼠成模后随机分为模型组（61 只，蒸馏水），缬沙坦组［47 只，缬沙坦（14.4 mg／kg）］，中药早期给药组（47 只），中药中期给药组23 只、中药晚期给药组23 只均予通络益肾方水煎液灌胃（23.8 g／kg）。早期给药组成模后即开始灌胃，中期给药组、晚期给药组分别于成模后第9 周、22 周开始灌胃给药。正常对照组大鼠45 只予蒸馏水灌胃及基础饲料喂养。糖尿病肾病模型大鼠喂养高脂饲料（基础饲料75%、蛋黄粉5%、猪油20%）。治疗每日1 次，共持续26 周。定期监测血糖。

2.3 标本采集 第9、22 周分别处死正常对照组、缬沙坦组、模型组、中药早期给药组各10 只大鼠。余大鼠于26周末处死取材。3% 戊巴比妥钠（30 mg／kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，离心分离血清，-20 ℃保存。分离左肾皮质，用于透射电镜、实时荧光定量PCR 及流式细胞术检测。

2.4 指标检测

2.4.1 生化检测 考马斯亮兰法检测24 h U-Pr，全自动生化分析仪检测血尿素氮、血肌酐。

2.4.2 透射电镜观察足细胞超微结构 肾组织0.1 mol／L PBS 漂洗，4 ℃、1%锇酸溶液固定；PBS 漂洗，脱水，包埋，切片，染色，透射电镜观察、拍片。

2.4.3 RT-PCR 测定肾组织TFAM、 PGC-1a mRNA 表达引物由Primer 5.0 辅助设计，序列见表1。PCR 扩增条件为95 ℃、5 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 cycles。2-△△Ct计算目的基因相对表达量。

表1 引物序列

2.4.4 肾小球线粒体膜电位 JC-10 染色及流式细胞仪检测。肾皮质剪成1 mm3小块，无EDTA 胰酶消化，100 μm滤网过滤，1 000 r／min 离心5 min，收集细胞沉淀，加入JC-10 在37 ℃，5% CO2培养箱孵育20 min；室温1 000 r／min离心5 min，上机检测。

2.5 统计学分析 应用SPSS 19.0 录入数据，数据以（）表示，多组间比较采用One-way ANOVA 法，以P＜0.05示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 通络益肾方对DN 大鼠24 h U-Pr、肾功能的影响 模型组大鼠24 h U-Pr、Scr、BUN 在实验期间持续升高（P＜0.01），提示DN 病情进展。与模型组比较，中药早期组9、22、26 周时24 h U-Pr、Scr、BUN 均降低（P＜0.05，P＜0.01），中期组22、26 周时上述指标亦下降（P＜0.05、 P＜0.01），晚期组26 周时24 h U-Pr 下降（P＜0.05）。26 周时，与中药早期组比较，中期组、晚期组24 h U-Pr、Scr、BUN 升高（P＜0.01）。提示通络益肾方可显著降低DN 大鼠24 h U-Pr，改善肾功能，但早期干预效果优于中、晚期。见表2、图1～2。

表2 通络益肾方对24 h U-Pr 的影响（，n＝10）

表2 通络益肾方对24 h U-Pr 的影响（，n＝10）

注：与正常对照组比较，※※P＜0.01；与模型组比较，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；与缬沙坦组比较，△P＜0.05；与中药早期组比较，∧P＜0.05，∧∧P＜0.01。

图1 通络益肾方对糖尿病肾病模型大鼠肾功能的影响（，n＝10）

3.2 通络益肾方对足细胞线粒体超微结构的影响 正常对照组大鼠足细胞线粒体形态饱满、规则，呈圆形、卵圆形或杆状，嵴清晰完整。模型组可见不同程度的肾小球基底膜增厚，线粒体肿胀、破损、数量减少，嵴紊乱，随时间延长线粒体损伤程度逐渐加重，可见线粒体重度肿胀甚或破裂，数量明显减少，嵴断裂或消失。各给药组线粒体损伤程度均减轻，尤以中药早期组与缬沙坦组线粒体损伤程度最轻。见图2。

图2 各组大鼠不同时期肾小球足细胞线粒体超微结构比较（×50 000）

3.3 通络益肾方对TFAM、 PGC-1α mRNA 的影响 模型组9、22、26 周时TFAM、 PGC-1α mRNA 表达均较正常对照组降低（P＜0.01），且随时间的延长呈持续下调趋势。与模型组比较，中药早期组各时间点TFAM、 PGC-1α mRNA 表达均升高（P＜0.01）；中药中期组、晚期组26 周时上述指标上调（P＜0.05）。26 周时，中期组、晚期组表达均较中药早期组降低（P＜0.01）。见图3。

图3 通络益肾方对糖尿病肾病模型大鼠TFAM、 PGC-1α mRNA 表达的影响（，n＝10）

3.4 通络益肾方对肾小球线粒体膜电位的影响 与正常对照组比较，模型组线粒体膜电位水平呈时间依赖性下降（P＜0.01）。与模型组比较，缬沙坦组、中药早期组22 周、26 周时膜电位均升高（P＜0.05，P＜0.01）。26 周时与中药早期组比较，中药中期组、晚期组膜电位水平降低（P＜0.01）。说明通络益肾方可提高DN 大鼠线粒体膜电位水平，且早期干预效果优于中、晚期。见图4。

图4 通络益肾方对糖尿病肾病模型大鼠线粒体膜电位的影响（，n＝10）

4 讨论

足细胞损伤、凋亡是DN 蛋白尿发生和肾小球硬化的中心靶点［10］。足细胞内有丰富的线粒体，为其完成各项功能提供能量支持。DN 时肾脏氧化应激损伤与线粒体功能障碍密切相关［10-11］。长期高糖高脂环境损伤足细胞线粒体，使ROS 大量积聚，线粒体发生氧化应激，线粒体功能损伤，ATP 产生减少，膜电位下降，线粒体通透性增大，导致足细胞凋亡、肾小球硬化。因此，改善线粒体功能、纠正其功能紊乱已成为治疗DN 的新策略。

线粒体膜电位是评估线粒体功能的重要指标。膜电位异常可导致ATP 生成障碍，线粒体通透性增高而诱发细胞凋亡。膜电位水平下降是细胞凋亡的先兆［12］，而抑制膜电位的下降则可抑制细胞凋亡。足细胞损伤时其膜电位水平显著降低［13］；白藜芦醇可升高高糖培养的肾小管上皮细胞线粒体膜电位而抑制小管上皮细胞的凋亡［14］。本研究中，模型组大鼠线粒体损伤随时间延长持续加重，线粒体膜电位水平持续下降。各中药组线粒体损伤程度均减轻，但早期给药组线粒体损伤程度最轻，线粒体膜电位水平显著升高（P＜0.01），优于中期及晚期给药组（P ＜0.01 或P ＜0.05）。说明通络益肾方可保护线粒体结构，升高线粒体膜电位，且早期干预优于中期和晚期。

过氧化物酶增殖物激活受体γ 辅助活化因子1（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1ɑ）可促进线粒体的生成，恢复线粒体膜电位，清除ROS、抑制氧化应激［15-17］。生理情况下，PGC-1α 在肾脏中高表达。急性肾损伤时PGC-1α 表达下调［18］，线粒体合成减少，肾脏缺氧而发生肾间质纤维化。醛固酮诱导的足细胞损伤中PGC-1α 表达下调、线粒体破坏和细胞凋亡，增加PGC-1α 表达后可以改善［19］。替米沙坦通过激活PGC-1α 降低氧化应激反应发挥肾保护机制［20］。提示PGC-1α 异常与肾脏病密切相关。线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）是PGC-1α 的下游靶基因，能维持线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的空间构象，调控 mtDNA 的复制、转录激活及损伤修复［21］。PGC-1α／TFAM信号通路可促进线粒体增殖，提高线粒体功能［22］。本研究中，模型组大鼠PGC-1α、 TFAM mRNA 表达呈时间依赖性递减（P＜0.01），通络益肾方早期组PGC-1α、 TFAM mRNA 表达均较模型组升高（P＜0.01）。说明通络益肾方能促进DN 大鼠线粒体的生物合成，但早期干预优于中晚期。本研究结果从线粒体功能障碍角度阐明了通络益肾方的作用机制，以期为该方的科学、合理应用提供实验依据。