一种高通量检测方法评估多种杀虫剂协同作用于蜜蜂的毒性风险

刘玉玲 李兴安 王志 陈东海 牛庆生│编译

吉林省养蜂科学研究所，吉林132108

蜜蜂几乎总是暴露在杀虫剂之中。最近，我们进行了一项检测蜂巢蜡质中杀虫剂残留的研究，受检对象是纽约198名养蜂人的蜂巢蜡质，结果显示197名养蜂人的蜂巢蜡质有杀虫剂残留，蜂巢蜡质平均含有6种杀虫剂。而这不算糟糕，研究仅是证明蜜蜂通常暴露于低剂量的杀虫剂。2019年，我们进行一项蜂箱饲料中杀虫剂残留的研究，受检对象是纽约苹果园授粉蜜蜂的蜂箱饲料，结果显示蜂箱饲料平均含有14种杀虫剂，而且一些蜂箱饲料最多含有23种杀虫剂。

多种杀虫剂毒作用蜜蜂的现状给美国环境保护署（EPA）等环境监管机构进行杀虫剂风险评估提出一个重要问题：如何确定特定环境下杀虫剂的使用剂量，以及如何限制其毒作用风险的使用剂量。然而，美国环境保护署和其他环境监管机构仅考虑如何评估杀虫剂单独使用的毒性风险，没有考虑如何评估多种杀虫剂联合使用的毒性风险。为此，我们草拟了一个不算完整的杀虫剂毒作用风险图例：首先，蜜蜂在饲养过程中不可避免地接触杀虫剂；其次，一些杀虫剂通过相互作用（即协同作用）大大增加了自身的毒性，比单一杀虫剂具有更大的毒作用。

当蜜蜂同时暴露于数百种杀虫剂时，我们该如何评估多种杀虫剂联合作用于蜜蜂的毒性风险呢？简单的数学计算方法是，如果1只蜜蜂同时暴露于100种杀虫剂，那么想评估2种杀虫剂组合暴露对蜜蜂的毒作用，就需要组织4950次实验才能进行总的风险评估；想评估3种杀虫剂组合暴露对蜜蜂的毒作用，就需要组织161700次实验才能进行总的风险评估。以此类推，该如何评估14种杀虫剂组合暴露对蜜蜂的毒作用？也就是说，需要组织多少次实验才能获得上述纽约苹果园授粉蜜蜂的蜂箱饲料检测结果呢？答案非常令人吃惊，是44186942677323600次实验。

图1 荧光扫描384微孔板检测杀虫剂干扰蜜蜂CYP9Q3解毒酶催化BCF底物生成基-4-三氟甲基香豆素（HC）产物的技术原理

如果要解决这个重要问题，需要开发一种快速而有效的筛选方法，以明确蜜蜂是否面临多种杀虫剂协同作用的毒性风险。为了回答这个问题，我们实验室提出第39个研究课题：蜜蜂细胞色素P450酶用于分子检测杀虫剂毒作用的风险评估指标。这项研究旨在传统的评估杀虫剂毒性风险基础上增加一种新方法。Julian Haas和Ralf Nauen将研究成果发表于美国环境科学类期刊《环境国际》（2021,147:106372）。

通过参考实验室初步筛选人药检测方法，以确定蜜蜂体内是否存在药物与药物之间的相互作用。首先，通过体外实验在384微孔板建立杀虫剂抑制CYP9Q3解毒酶的活力测定方法，CYP9Q3解毒酶是细胞色素P450 基因CYP9Q3编码的药物代谢酶异构体，能够将杀虫剂分解为无毒产物；其次，通过体内实验检测杀虫剂对蜜蜂CYP9Q3解毒酶的活力影响；最后，比较体内、外检测结果。

在384微孔板图片上方，CYP9Q3解毒酶将BFC底物分解为HC产物。在杀虫剂存在时，CYP9Q3解毒酶不能将BFC全部转化为HC (箭头显示)，存在两个可能：一种原因是杀虫剂充当BFC的竞争性底物，也被CYP9Q3解毒酶降解，噻虫啉（TCP）、啶虫脒（ACT）等新烟碱类杀虫剂在蜜蜂体内能够被CYP9Q3解毒酶降解；另一种原因是杀虫剂充当酶的抑制剂，使CYP9Q3解毒酶在降解其他类似底物时活力降低。稍后我们看到，一些杀真菌剂通过抑制CYP9Q3解毒酶的活性，干扰蜜蜂对噻虫啉（TCP）和啶虫脒（ACT）的解毒能力。在384微孔板图片下方，微孔板检测实验的不同结果是：比之于正常的CYP9Q3解毒酶的酶促反应（浅色曲线），CYP9Q3解毒酶被杀虫剂抑制后在添加更多BFC底物时没有产生更多数量HC（深色曲线），这意味着杀虫剂干扰了CYP9Q3解毒酶的正常催化活性，成为CYP9Q3解毒酶的竞争性底物，或者成为CYP9Q3解毒酶的抑制剂。

现在看来，微孔板检测实验通过测定蜜蜂CYP9Q3解毒酶的酶活力提供如下3个方面的研究证据。首先，蜜蜂CYP9Q3解毒酶是否能够降解噻虫啉（TCP）、啶虫脒（ACT）、吡虫啉、噻虫嗪等新烟碱类杀虫剂以及拟除虫菊酯类杀虫剂（也被用作灭螨剂）；其次，三氟咪唑、丙环唑、三唑酮、环氧环唑、烯唑环唑、丙硫菌唑、丙氯唑和偶氮菌酯等杀真菌剂是否干扰蜜蜂CYP9Q3解毒酶；最后，噻虫啉（TCP）和啶虫脒（ACT）是否单独毒作用于蜜蜂，还是与杀真菌剂共同毒作用于蜜蜂。比较体外实验获得的LC50值与体内实验获得的LD50值，就找到了问题的答案。

微孔板检测法是否证明上述杀虫剂被蜜蜂CYP9Q3解毒酶分解? 一些结果是肯定的，例如，蜜蜂CYP9Q3解毒酶能分解噻虫啉（TCP）、啶虫脒（ACT）和氟缬氨酸；而另外一些结果是否定的，例如，蜜蜂CYP9Q3解毒酶不能分解吡虫啉和噻虫嗪。微孔板检测法是否证明上述杀真菌剂抑制蜜蜂CYP9Q3解毒酶? 结果也是既有肯定的也有否定的。这项研究展示Julian Haas和Ralf Nauen研究成果的新突破，换句话说，就蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制而言，所有杀真菌剂的效果并不相同。

那么，有证据表明杀真菌剂与杀虫剂之间存在协同性？有，看看蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制的致死效应（LD50）就清楚。微孔板检测实验通过评估蜜蜂CYP9Q3解毒酶抑制的致死效应（LD50），可以预测啶虫脒（ACT）与8种杀真菌剂存在协同作用。此外，还测试另一种蜜蜂CYP9Q2解毒酶，发现这个酶的酶活力下降与蜜蜂死亡率之间存在更好的相关性。

显然，Julian Haas和Ralf Nauen关于杀虫剂毒性与蜜蜂致死效应之间的相关分析，提供了一种蜜蜂杀虫剂毒性风险评估的检测方法，也提高了人们对杀虫剂毒作用机制的认识水平。鉴于微孔板检测实验具有高通量分析的技术优势，CYP9Q3解毒酶的活性测定在快速筛选多种农药组合毒性作用方面具有巨大开发潜力。在本研究中，某些杀虫剂之间存在强的协同作用，例如，咪鲜胺（PRC）能够将噻虫啉（TCP）的致蜜蜂急性毒作用水平提高到700倍，而且人们已经认识到杀虫剂协同作用增加了蜜蜂的致死效应，因此微孔板检测结果对美国环境保护署等监管机构的影响被低估了。

Julian Haas和Ralf Nauen的这项研究提示我们，扩大微孔板检测范围（例如，蜜蜂其他解毒酶和其他酶系统）会非常重要。在本研究中，蜜蜂CYP9Q3解毒酶仅对噻虫啉（TCP）和啶虫脒（ACT）等新烟碱类杀虫剂具有明显的降解作用，但是对吡虫啉、噻虫嗪等其他新烟碱类杀虫剂没有降解作用。蜜蜂CYP9Q3解毒酶对其他类型杀虫剂有降解作用吗？例如，有机磷杀虫剂，氨基甲酸酯杀虫剂，以及最近公布的蜜蜂急性毒性低毒类化学杀虫剂？除此之外，还有蜜蜂其他酶或非酶系统用来评估杀虫剂协同毒性?

Julian Haas和Ralf Nauen通过这项研究向我们开启了一个非常重要的研究：我们该如何通过后续实验证明微孔板检测方法的可行性，以改进蜜蜂暴露于多种杀虫剂的风险评估方法。