施氮和根系分隔对玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿根系形态和固氮能力的影响

王立波，邵泽强，陆文龙

(1.吉林农业科技学院 生物与制药工程学院，吉林 吉林 132101；2.吉林化工学院 资源与环境工程学院，吉林 吉林 132022；3.吉林农业大学 资源与环境学院，吉林 长春 130118)

吉林省地处我国东北农牧交错区[1]，是我国重要的商品粮和畜牧业生产基地，为我国的社会稳定发展提供了有力保障。但是，长期的集约化种植和过量施用化学氮肥对该地区的粮食产量和土壤生态环境产生了负面影响[2]，严重制约了当地农业发展。因此，如何调整作物种植结构和减量施用化学氮肥是该地区农业可持续发展面临的主要问题。间作种植模式因其在我国具有悠久的历史和诸多的优势成为当前解决上述问题的主要途径[3]，尤其是禾豆间作在氮素高效利用方面具有明显的优势。玉米和紫花苜蓿是该地区主要的粮食作物和豆科牧草，玉米/紫花苜蓿间作具有广阔的应用前景。

禾豆间作能够利用豆科作物的生物固氮特性[4]，将空气的氮气固定转变成生长需要的铵态氮，更重要的是豆科作物还能将固定的一部分氮素转移给与之间作的作物吸收利用[5]。这样在生产中就能达到减少氮肥施用量的目的[6-7]。大量研究发现，在禾豆间作体系中，豆科作物的结瘤数量、质量和固氮量得到提高[8-11]。LI等[12]发现，与豌豆单作相比，玉米/豌豆间作体系可以使豌豆的根瘤数量和质量分别增加29.63%和48.21%。采用15N自然丰度法研究玉米/蚕豆间作系统发现，与蚕豆单作相比，玉米/蚕豆间作体系可以使蚕豆的单株根瘤的质量平均增加22.5%，同时在初花期、盛花期、鼓粒期和成熟期的固氮量分别提高8%～33%、54%～61%、18%～50%和7%～72%，说明间作增强了蚕豆根瘤的固氮能力[11]。发生上述现象的主要机制可能是在禾豆间作体系中根系接触产生了一系列的生理生化反应，从而促进了豆科固氮能力的增强[13]。由此可见，间作体系中作物之间的距离是影响豆科作物生物固氮能力的重要因素[4]。SUN等[14]研究发现，根系形态的变化是影响玉米/紫花苜蓿间作体系中氮素高效利用的重要因素。由此可见，根系形态是影响作物氮素吸收和生长的重要因素[15]。然而，在玉米/紫花苜蓿间作体系中，根系形态的改变是否也同样影响紫花苜蓿根瘤的固氮能力到目前为止还未见报道。为此，探究施氮和根系分割对玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿根系形态和固氮特征的影响，为充分挖掘豆科作物的生物固氮潜力、降低化学氮肥施用量以及现代农业可持续发展提供重要理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验地点概况及试验材料

试验于2016年在吉林农业大学现代化温室(43°56′30″N、126°27′55″E，海拔190 m)中进行，该区属于温带大陆性季风气候，四季分明，雨热同期。试验作物生长季内的平均气温19.4 ℃，无霜期130 d，降雨量约498.4 mm，积温2 600 ℃。供试土壤为黑土，具体理化性质见表1。

供试玉米和紫花苜蓿品种分别为郑单958(由吉林省四平市神农种业有限公司提供)和东苜1号(由东北师范大学草地所提供)。供试紫花苜蓿根瘤菌液由吉林农业大学资源与环境学院微生物教研室提供，含根瘤菌数3.0×107个/mL。供试肥料由吉林隆源农业股份有限公司提供，氮肥是尿素(含N 46%)，磷肥为过磷酸钙(含P2O546%)，钾肥为氯化钾(含K2O 60%)。

表1 供试土壤的理化性质Tab.1 Physical and chemical properties of the tested soil

1.2 试验设计

采用盆栽试验，每个盆(45 cm×30 cm×50 cm)中装51 kg干土，播种2～3粒玉米种子，在玉米二叶期开始间苗，每个盆中只保留1株玉米。紫花苜蓿播种量为18 kg/hm2，在苗期进行定植和间苗。试验采用完全随机区组设计，设2个施氮水平：不施氮(N0)和施氮(N1)，3种根系分隔模式：塑料板分隔(PSS)、尼龙网分隔(NNS)、根系完全不分隔(NS)，每个处理设4次重复。为了确保紫花苜蓿在试验过程中能够充分结瘤，紫花苜蓿间苗后在其根部浇灌20 mL/盆的根瘤菌液。为了同时满足玉米和紫花苜蓿生长的需要，施N 225.0 kg/hm2、P2O5135.0 kg/hm2、K2O 90.0 kg/hm2。根据上述施肥量进行换算，盆栽N1处理的N、P2O5、K2O施用量分别为0.20、0.12、0.08 g/kg，N0处理P2O5、K2O施用量同N1处理。播种时间为6月1日，紫花苜蓿根系挖掘时间为10月18日，紫花苜蓿接种根瘤菌时间为6月18日。适时灌水以满足供试作物对水分的需求，除草和病虫害的防治等措施均按当地常规生产进行。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 根系形态指标 玉米成熟期，采用挖掘法将紫花苜蓿根系整体挖出，抖落根系上附着的大土块，将根系放到纱网中用水管冲洗干净，并带回实验室，用吸水纸将根系上的水吸干，并用剪子剪成等长度的根段，保存在75%的乙醇中，然后用Epson(V800)扫描仪扫描根系，扫描图片用WinRHIZO根系分析系统(Regent公司,Canada,2013)进行分析，获得紫花苜蓿的根长、根表面积、根体积等指标。本研究将根系直径设置4个茎级，D1：0<直径≤0.5 mm，D2：0.5 mm<直径≤1 mm，D3：1 mm<直径≤1.5 mm，D4：直径>1.5 mm。

1.3.2 根瘤数、根瘤干质量及豆血红蛋白含量 10月18日开始取样，采用挖掘法用铁锨挖约50 cm 深，取出整株紫花苜蓿 10 株置于编织袋上，轻轻抖落根上的土，收集掉落的根瘤，并将抖落土中的根瘤挑选干净。将取回的样品放在0.15 mm筛中用流水冲洗，摘可见根瘤，计数，风干，测定根瘤干质量；紫花苜蓿根瘤的豆血红蛋白含量参照WANG等[4]的方法进行测定。

1.3.3 固氮率及固氮量 本研究采用自然丰度法测定紫花苜蓿的固氮率，计算方法参考SHEARER等[16]的公式。

式中，δ15N为植物地上部15N丰度相对于大气15N丰度的变化，B为紫花苜蓿在沙培试验中不施氮条件下植株中的15N自然丰度值。在前期研究中获知B值为-0.92[4]。

固氮量采用下面公式[4]进行计算：

固氮量=固氮率×紫花苜蓿干质量×紫花苜蓿氮含量。

1.4 数据处理

采用Excel 2010对数据进行整理、统计和分析，采用SAS 9.2双因素ANOVA分析和多重比较法(Tukey’s HSD)检验各处理间的差异显著性，采用GraphPad Prism 6.02绘图。

2 结果与分析

2.1 施氮和根系分隔对玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿不同茎级根系形态的影响

由图1可知，施氮能够增加紫花苜蓿根系不同茎级根长。与N0处理相比，施氮处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根长分别增加42.4%、14.6%、0.7%、31.8%。其中，D1茎级根长增加幅度最大，D3茎级增加幅度最小。在4个茎级中，D1茎基所占比例最大，D3茎级所占比例最小。

根系分隔增加紫花苜蓿4个茎级的根长(图1)。在N0条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根长分别降低19.0%、22.4%、22.7%、40.2%和9.2%、19.5%、16.2%、9.5%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根长分别降低10.7%、3.6%、7.8%、33.9%。在N1条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根长分别降低17.5%、32.3%、26.7%、19.1%和12.0%、21.8%、13.9%、2.6%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根长分别降低6.3%、13.5%、14.8%、16.9%。

施氮能够增加紫花苜蓿根系不同茎级根表面积(图1)。与N0处理相比，施氮处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根表面积分别增加17.9%、7.9%、19.3%、28.6%。其中，D4茎级根表面积增加幅度最大，D2茎级增加幅度最小。4个茎级中，根表面积以D4茎级所占比例最大，D3茎级所占比例最小。

根系分隔方式增加紫花苜蓿4个茎级根表面积(图1)。在N0条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根表面积分别降低19.5%、18.0%、36.4%、42.6%和5.6%、5.1%、10.3%、30.4%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根表面积分别降低14.7%、13.6%、29.1%、17.6%。在N1条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根表面积分别降低24.1%、12.8%、41.1%、35.2%和16.7%、6.1%、28.2%、10.2%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根表面积分别降低8.8%、7.1%、17.9%、27.9%。

施氮能够增加紫花苜蓿根系不同茎级根体积(图1)。与N0处理相比，施氮处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根体积分别增加8.1%、32.3%、4.7%、22.3%。其中，D2茎级根体积增加幅度最大，D3茎级增加幅度最小。4个茎级中，根体积以D4茎级所占比例最大，D1茎级所占比例最低(图1)。

根系分隔增加紫花苜蓿4个茎级根体积(图1)。在N0条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根体积分别降低48.1%、21.6%、14.7%、63.0%和30.4%、12.4%、7.5%、43.8%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根体积分别降低25.4%、10.4%、7.8%、34.2%。在N1条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根体积分别降低32.7%、28.1%、18.0%、50.4%和42.2%、8.2%、12.2%、31.5%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四个茎级根体积分别降低16.5%、21.7%、6.6% 27.5%。

总之，在玉米/紫花苜蓿间作体系中，施氮能促进紫花苜蓿不同茎级根长、根表面积、根体积增加，根长以D1增幅最大，根表面积以D4茎级增幅最大，根体积以D2茎级增幅最大；根系分隔能促进紫花苜蓿根长、根表面积、根体积增加，对D4茎级影响最大，相反的，根系不分割会抑制紫花苜蓿根系生长。

2.2 施氮和根系分隔对玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿根瘤数、根瘤干质量的影响

施氮水平、根系分隔方式以及二者的交互作用对紫花苜蓿根瘤数、根瘤干质量的影响均达到显著、极显著水平(表2)。由表2可知，与N0处理相比，N1处理紫花苜蓿的根瘤数、根瘤干质量分别降低33.8%、64.5%。N0条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿的根瘤数、根瘤干质量分别增加69.5%、76.4%和49.3%、61.4%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿的根瘤数、根瘤干质量分别增加13.5%、9.3%。N1条件下，与PSS处理相比， NS和NNS处理紫花苜蓿的根瘤数、根瘤干质量分别增加45.5%、97.6%和42.8%、45.5%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿的根瘤数、根瘤干质量分别增加1.9%、35.8%。

2.3 施氮和根系分隔对玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿固氮量和固氮率的影响

施氮水平、根系分隔方式以及二者的交互作用对紫花苜蓿的固氮率和固氮量影响极显著(表3)。由表3可知，与N0处理相比， N1处理紫花苜蓿的固氮率和固氮量分别降低29.4%和17.0%。在N0条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分别增加148.2%、52.9%和66.0%、41.9%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分别增加49.5%和7.8%。在N1条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分别增加105.5%、30.0%和58.6%、26.2%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分别增加29.6%、2.9%。

2.4 施氮和根系分隔对玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿根瘤豆血红蛋白含量的影响

由图2可知，与N0处理相比， N1处理紫花苜蓿的根瘤豆血红蛋白含量降低55.4%。在N0条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿的根瘤豆血红蛋白含量分别增加73.3%和43.3%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿的根瘤豆血红蛋白含量增加20.9%。在N1条件下，与PSS处理相比，NS和NNS处理紫花苜蓿的根瘤豆血红蛋白含量分别增加42.6%和18.2%；与NNS处理相比，NS处理紫花苜蓿的根瘤豆血红蛋白含量增加20.7%。

表2 施氮和根系分隔对紫花苜蓿根瘤数量和干质量的影响Tab.2 Effects of nitrogen application levels and root separation patterns on the number and dry weight of alfalfa nodules

表3 施氮和根系分隔对紫花苜蓿固氮率和固氮量的影响Tab.3 Effects of nitrogen application levels and root separation patterns on the nitrogen fixation rate and nitrogen fixation amount of alfalfa nodules

2.5 玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿固氮率与其根瘤数、根瘤干质量、豆血红蛋白含量、根系形态的相关分析

由图3可知，无论施氮与否，玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿固氮率与根瘤数(N0：R2=0.747 9,P<0.01；N1:R2=0.581 5,P<0.01)、根瘤干质量(N0：R2=0.642 6,P<0.01；N1:R2=0.555 4,P<0.01)、根瘤豆血红蛋白含量(N0：R2=0.916 2,P<0.01；N1:R2=0.745 0,P<0.01)均呈极显著正相关，与紫花苜蓿根长(N0：R2=0.834 2,P<0.01；N1:R2=0.655 8,P<0.01)、根表面积(N0：R2=0.830 0,P<0.01；N1:R2=0.773 3,P<0.01)、根体积(N0：R2=0.892 3,P<0.01；N1:R2=0.923 8,P<0.01)均呈极显著负相关。

3 结论与讨论

施氮能够促进植物的生长[17]，在本试验中也取得了类似的结果。但是，在本研究中，施氮降低了紫花苜蓿的根瘤数、根瘤干质量、固氮率、固氮量和根瘤豆血红蛋白含量，说明施氮会抑制玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿的固氮能力，存在“氮阻遏”现象[8]。因此，在实际生产中应该调控好氮肥的施用量，以使紫花苜蓿的生物固氮能力达到最大化。

本研究还发现，无论施氮与否，3种根系分隔条件下紫花苜蓿的根瘤数、根瘤干质量、固氮率、固氮量和根瘤豆血红蛋白含量都存在显著的差异。紫花苜蓿的根瘤量、根瘤干质量、固氮率、固氮量和根瘤豆血红蛋白含量均表现为NS>NNS>PSS。说明玉米/紫花苜蓿间作体系中存在明显的种间交互作用，这在蚕豆/玉米间作体系中也得到了验证[8]，同时也说明在NS条件下存在明显的种间竞争作用[18]，而前人的研究表明，在禾豆间作体系中禾本科作物的竞争能力一般大于豆科作物[19-20]，种间的竞争促进了紫花苜蓿的生物固氮能力。3种根系分隔方式在施氮条件下都存在明显的“氮阻遏”现象，3种根系分隔方式下紫花苜蓿的根瘤数、根瘤干质量、固氮率、固氮量和根瘤豆血红蛋白含量均是在PSS条件下最低，在NS条件下最高。这说明，玉米/紫花苜蓿间作具有明显的减缓“氮阻遏”效应，这与玉米/蚕豆间作系统中获得的试验结果是一致的[8]。另外，NS和NNS条件下，紫花苜蓿的根瘤数、根瘤干质量、固氮率、固氮量和根瘤豆血红蛋白含量也都有不同程度的差异，这说明，在玉米/紫花苜蓿间作体系中除了水分和养分的流动能够影响紫花苜蓿的生长和生物固氮能力之外，根系接触也是影响紫花苜蓿生长和生物固氮能力的一个重要因素。可能的原因是在玉米/紫花苜蓿间作体系中根系接触缩短了水分和养分的运输距离[21]。相关性分析表明，玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿的固氮率与根瘤数、根瘤干质量和豆血红蛋白含量在N0和N1条件下均呈极显著的正相关关系，这与REDIET等[22]在玉米/大豆间作体系的研究结果是一致的。因此，在研究中可以采用豆科作物的根瘤数、根瘤干质量和豆血红蛋白含量指标来评价豆科作物的固氮能力[22-23]。同时，通过分析紫花苜蓿4个茎级根系的形态发现，无论施氮与否，在NS和NNS条件下紫花苜蓿4个茎级根系的根长、根表面积和根体积都受到明显的抑制，显著低于PSS处理。但在茎级为0～0.5 mm时根长、根表面积和根体积明显大于其他茎级。相关性分析表明，在玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿的根长、根表面积和根体积与固氮率均呈极显著负相关，由此可见，在玉米/紫花苜蓿间作体系中，玉米和紫花苜蓿之间存在明显的种间竞争作用[5]。

综上所述，施氮和根系分隔都能促进玉米/紫花苜蓿间作体系中紫花苜蓿根系生长，但会抑制紫花苜蓿的固氮能力。在实际生产中，玉米/紫花苜蓿间作体系可以降低化学氮肥的施用量，这对于减肥增效和农业的可持续发展具有重要的应用价值。