头花杜鹃叶中精油成分及其抑菌活性研究

纪若薇，杨 扬，林鹏程

（青海民族大学药学院/青海省青藏高原植物化学重点实验室/青海省药物分析重点实验室，西宁 810007）

头花杜鹃（Rhododendron capitatum）系杜鹃花科杜鹃属植物，是中国西北地区杜鹃属中分布较广的一个种，产于青海、甘肃、四川、西藏等地［1］。藏医常以其花、叶入药，性温，味辛，治培根病、肺部疾病等［2］。研究发现头花杜鹃精油具有明显的祛痰、镇咳作用［3］。马萍等［4］利用GC-MS 对头花杜鹃精油成分进行了分析，发现主要成分为蒎烯、丁酮、月桂烯、石竹烯等。头花杜鹃在青海省蕴藏量丰富，为进一步开发利用该资源，对入药部位叶中精油的抑菌活性和不同季节其精油成分的差异进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

头花杜鹃于2018 年采于青海省互助北山林场，由青海民族大学药学院林鹏程教授鉴定。活性测试菌种均购于中国药品生物制品检定所，具体见表1。

正构烷烃系列化合物（C7～C30）购自上海安谱科学仪器有限公司；其余试剂均为国产分析纯；营养琼脂购自北京化学试剂公司；蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司；牛肉膏购自北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠购自天津市红岩化学试剂厂。

Agilent 7890/5975C-GC/MS 气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；AL244 型分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；HZQ-X100A 型恒温振荡培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；GZX-9076MBE 型数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；AS-1060L 型高压灭菌锅，邝杏生物技术有限公司；SW-CJ-2FD 型洁净工作台，苏州净化设备有限公司。

表1 供试菌种总汇

1.2 方法

1.2.1 精油成分的提取 取新鲜头花杜鹃的叶粉碎，参照《中华人民共和国药典》（2015 年版），用水蒸气蒸馏法提取精油，用1 g 无水硫酸钠干燥，再取上层清液作为精油供试液。

1.2.2 GC-MS 分析条件

1）色谱条件。色谱柱为HP-5 弹性石英毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；按设定程序升温；载气He；载气流量2 mL/min；汽化室温度220 ℃；进样量0.4 μL；分流比20∶1。用于顶空直接进样的程序升温条件：初始温度40 ℃，保持2 min，以6 ℃/min 升至80 ℃，保持 1 min，再以 5 ℃/min 升至160 ℃，保持 1 min 最后以10 ℃/min 升至290 ℃，保持 6 min。

2）质谱条件。离子源EI；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；传输线温度200 ℃；数据采集全扫描；质量范围50～500 amu。

1.2.3 保留指数（KI）测定 精密移取正构烷烃混合对照品，顶空进样分析，用于计算精油各组分的KI值；分别测定各个条件下正构烷烃的保留时间。根据保留指数公式计算各组分的KI值，KI= 100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)，其中tx、tn和tn+1分别为被分析组分和碳原子数为n和n+1的正烷烃(tn

1.2.4 菌种活化 接种藤黄微球菌、大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌等细菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30～35 ℃培养18～24 h。接种白色念球菌和黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁培养基上，23～28 ℃培养3～5 d。

1.2.5 菌悬液的制备 将上述细菌培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度为108cfu/mL 的菌悬液。将上述真菌培养物加入3～5 mL 含0.05%（V/V）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液，孢子洗脱后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用无菌的含0.05%（V/V）聚山梨酯80 的0.9%氯化钠溶液配制成浓度为108cfu/mL 的孢子悬液。

1.2.6 抑菌圈的测定 采用滤纸片琼脂平板扩散法，对头花杜鹃叶精油抑菌圈的直径进行测定。用移液枪从已制备好的待试菌悬液中吸取0.2 mL，加入到200 mL 的营养琼脂培养基或马丁氏培养基中，混合均匀。将混合好的带有菌悬液的培养基依次倒入培养皿中，待培养基凝固。用移液枪分别吸取3、5、7 和 10 μL 精油，喷洒在已灭菌、直径为 6 mm 的圆形滤纸片上，用已灭菌的镊子将浸有不同浓度的精油滤纸片贴在同一培养基上。将贴好的培养基倒置在培养箱中，细菌30 ℃培养18～24 h，真菌25 ℃培养24～48 h 后测量抑菌圈的直径。每个菌种做5 次平行试验，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 头花杜鹃叶精油的颜色及出油率

分别提取1、6、10 月采得的头花杜鹃叶精油，所得提取物均为淡黄色，出油率分别为0.25%、0.32%、0.30%。

2.2 头花杜鹃叶精油成分分析

对头花杜鹃叶精油成分进行GC-MS 分析，按峰面积归一化法计算求得各化学成分的峰面积相对百分含量。通过MSD 化学工作站检索NIST08 标准质谱图库，对照各成分保留指数，结合相关文献解析［5-11］，确定所测样品中精油的化学成分（表2）。

从表2 可看出，6 月的精油含量最多，为80.42%，其 次 为 10 月 和 1 月 ，分 别 为 71.11% 和74.17%。1 月份的精油鉴定出化合物最多，达82 种，但各物质的含量相对偏小，含量最高的仅有21.33%。6 月和10 月的精油主成分相似，都以α-蒎烯和β-蒎烯为主，共同物质达17 种。1 月的精油成分与这两个月份有很大的差异，前者多以脂肪族化合物为主，后者多以萜类化合物为主。表明不同时间采得的头花杜鹃，其叶精油成分及含量具有很大差异。

表2 头花杜鹃精油化学成分

续表2

2.3 不同浓度头花杜鹃叶精油的抑菌活性

通过统计软件对不同浓度挥发油的抑菌活性进行方差分析，结果P>0.05，表示水平差异不显著，即同种植物不同浓度的挥发油对同一菌种的抑制作用差异不明显。可能与试验中浓度梯度变化较小有关，故研究挥发油对不同菌种的抑菌活性时，选取10 μL 进行比较。

2.4 头花杜鹃叶精油对不同菌种的抑菌活性

结果表明，头花杜鹃叶精油对铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉和大肠埃希氏杆菌没有抑制作用，对其他5 个菌种都有明显的抑制作用，其抑菌活性为藤黄微球菌>金黄色葡萄球菌>乙型溶血性链球菌>枯草芽孢杆菌>乙型副伤寒沙门菌。

表3 精油对菌种的抑菌活性

3 小结

采集了青海省互助北山不同月份的头花杜鹃，采用水蒸气蒸馏法提取叶中精油，采用顶空进样的方式，利用GC-MS技术分析头花杜鹃叶精油的成分，结果显示，头花杜鹃叶精油的组成随月份的不同差异较大，其中6 月的精油含量最多，1 月的精油化合物种类最多。

通过滤纸片法对头花杜鹃叶精油进行抑菌试验，结果表明，不同浓度的精油对同一菌种的抑制作用不具有显著性差异，该精油对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、乙型副伤寒沙门菌、乙型溶血性链球菌和枯草芽孢杆菌具有抑制作用，其中，对藤黄微球菌的抑菌活性最强，该结论或可对头花杜鹃叶精油的抑菌作用研究提供理论支持。