基于植物皂素提取液为发酵基质的酶表达及洗涤性能研究

刘玉婷，张瑜婷，蓝素桂，陈钰泉，李 丽，谭 强

（广西中医药大学药学院，南宁 530001）

皂素是一种高分子量糖苷，由与三萜苷或甾体苷元相连的糖基部分组成［1］。它们广泛分布在植物特别是一些草本植物或植物种子中，包括无患子、艾叶、皂荚、油茶子等［2-4］。皂素是天然的非离子表面活性剂，具有较好的洗涤性能，在水中能产生稳定、细腻丰富的泡沫［1］。皂素与人工合成的化学表面活性剂相比，具有来源广泛、生物降解性好、天然且低毒等优点，因此被广泛用于化妆品和洗涤剂等行业［5］。

许多酶试剂包括脂肪酶（E.C.3.1.1.3）、蛋白酶（E.C.3.4.21.14）和果胶酶（E.C.3.2.1.15）等被添加到化妆品和洗涤剂产品中，用于提高去污力和改善洗涤性能［6，7］。脂肪酶能催化三酰基甘油中羧基酯键裂解，随后释放脂肪酸和甘油，用于水解油脂，在洗涤剂行业有巨大的市场［8］。目前脂肪酶生产主要为微生物发酵法，芽孢杆菌（Bacillussp.）是脂肪酶主要的产生菌［9］。蛋白酶又称肽酶，是作用于蛋白质的肽键，将其水解成多肽和氨基酸，存在于所有的生物体内［10］。蛋白酶应用广泛，是国内销量巨大的酶制剂［11］。蛋白酶生产也主要为微生物发酵法，产生菌主要为芽孢杆菌［12］。果胶酶作为果胶类物质的水解酶，广泛存在于高等植物和各种微生物中，其中微生物中欧文氏杆菌（Erwiniasp.）、芽孢杆菌、假单胞杆菌（Pseudomonassp.）、曲霉属（Aspergillussp.）和灰霉菌属（Botrytissp.）等都能表达果胶酶［13-15］。果胶酶应用于皮革、丝绸等行业，在食品、饲料，特别是医药领域植物药的提取和洗涤等方面［16］。脂肪酶、蛋白酶和果胶酶等已是化妆品与洗涤剂产品的重要成分［17］，尤其是脂肪酶的去污作用最强，很多的洗涤剂产品通常选择添加脂肪酶。

试验以高浓度的植物皂素提取液为发酵基质，优化枯草芽孢杆菌CICC 23083 和地衣芽孢杆菌CICC 21085 发酵表达脂肪酶、蛋白酶和果胶酶，提高植物皂素液的去污力与洗涤效果，开发一款可降解、温和的富酶天然表面活性剂，为制备天然可降解的化妆品与洗涤剂产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 CICC 23083 购于商城北纳创联生物科技有限公司，CICC 21085 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 供试药剂及其他化合物 橄榄油购于麦克林公司；聚乙烯醇（AR）、酚酞购于成都市科龙化工试剂厂；三氯乙酸、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氢氧化钠（AR）购于天津市大茂化学试剂厂；福林酚、酪蛋白、DNS 试剂、果胶购于索莱宝生物科技有限公司；蛋白胨（AR）、95%乙醇（AR）、琼脂粉购于国药集团化学试剂有限公司；牛肉膏购于北京奥博里生物技术有限责任公司；茶皂素粉购于陕西承乾生物科技有限公司。

1.1.3 供试培养基 蛋白胨5.0 g/L，牛肉浸出物3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，调pH 7.0，固体培养基另加20 g/L琼脂粉。

1.1.4 仪器 立式蒸汽压力灭菌柜（YXQ-LS-50SII），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；恒温培养箱（LRH-250-S），韶关市泰宏医疗器械有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4），国华电器有限公司；紫外分光光度计（759S），上海仪电分析仪器有限公司；超净平台（VS-840K-U），苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；分析天平（BSA224S），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；恒温定时搅拌器（JB-3），上海雷磁创益仪器仪表有限公司；罗氏泡沫仪（2151），金坛区白塔安瑞实验仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 发酵基质的准备 植物皂素提取液的制备参照文献［18］。在所获提取液中加入50%茶皂素（皂素浓度为0.48 g/g）搅拌溶解后，调pH 为7，经高压灭菌锅121 ℃灭菌15 min 后，放冷即为发酵基质。

1.2.2 粗酶液的制备 取50 mL 发酵基质至250 mL三角瓶，接种5%菌液，在37 ℃，180 r/min 振荡发酵培养48 h。每隔8 h 取发酵样液，在4 000 r/min 下离心10 min，取上清液，为粗酶液。

1.2.3 酶活力测定 脂肪酶活力测定方法参照国标GB/T 23535-2009；蛋白酶活力测定方法参照国标GB/T 23527-2009；果胶酶活力测定方法参照文献［18］。

1.2.4 去污力测定 去污机由匀速搅拌机和恒温器组成，人工污垢配置方法、去污力测定方法参照国标GB 9985-2009。将去污机接通电源，设置速度为200 r/min，洗涤3 min，温度设为30 ℃。洗涤液由300 mL 自来水和适量发酵液混匀而成。将洁净的载玻片（称重为m0）均匀地铺上人工污垢，自然晾干（称重为m1）。将已知涂污量的载玻片夹在匀速搅拌机上，泡入洗涤液中浸泡1 min 后，开启搅拌机洗涤3 min 后，迅速取出洗后的污片，挂晾3 h 后称重，为m2。污片重量的损失用以评价发酵液的洗涤性能，分别做3 次平行试验取平均值。去污力计算公式：Y=（m1-m2）（/m1-m0）×100%。

1.2.5 泡沫高度测定 泡沫高度测定方法参照文献［19］。

2 结果与分析

2.1 单菌株发酵表达脂肪酶

在前期试验中，氮源影响（包括酵母膏、蛋白胨和硫酸铵等）的优化试验结果表明，添加3%酵母膏至发酵基质中，对CICC 21085 表达脂肪酶有显著的提高作用，最大酶活力到达166.7 U/mL。碳源（蔗糖、葡萄糖、麦芽糖）对脂肪酶表达的影响研究结果表明，蔗糖为最佳碳源。当底物中添加蔗糖浓度为5%，CICC 21085 发酵表达脂肪酶在16 h 获得最高酶活力，为116.7 U/mL。关于发酵液去污力的对比试验发现，脂肪酶对去污力的影响显著大于蛋白酶与果胶酶的混合液。基于前期研究结果，本研究进一步对CICC 23083 单菌株发酵表达蛋白酶与果胶酶，以及CICC 23083 和CICC 21085 双菌株混合发酵表达蛋白酶、果胶酶和脂肪酶的发酵工艺进行优化。

2.2 单菌株发酵表达蛋白酶与果胶酶

2.2.1 酵母膏的影响 在基质中分别加入1%、3%、5%和7%的酵母膏，每8 h 取样测定蛋白酶和果胶酶活力，结果如图1A 所示。在发酵32 h 内，蛋白酶活力不断增加，酶活力峰值出现在32 h。当酵母膏添加量为3%，蛋白酶活力有最好的表达，在32 h 获得最大酶活力，为792.6 U/mL。为未添加酵母膏直接发酵最大酶活力（216.8 U/mL）的3.7 倍。当酵母膏浓度进一步增加时，最高蛋白酶活力没有明显增加。果胶酶活力同样在32 h达到峰值（图1B）。当酵母膏浓度为3%时，最大果胶酶活力为4 352.9 U/mL，约是未添加酵母膏直接发酵最大酶活力（2 140.8 U/mL）的2.0 倍。根据结果推测，在高浓度皂素提取液中添加3%酵母膏即可为枯草芽孢杆菌提供足够的氮源，满足该菌生长所需的营养，又可促进蛋白酶和果胶酶的表达。

2.2.2 蔗糖的影响 分别往基质中加入3%、5%、7%和9%的蔗糖用于CICC 23083 发酵表达蛋白酶和果胶酶，每8 h 取样测定酶活力。从图2 可以看出，添加5%蔗糖时，蛋白酶活力和果胶酶活力分别在32 h 和16 h 达到最大值237.3 U/mL 和2 283.5 U/mL，分别约为未添加蔗糖直接发酵所获最大酶活力（分别为 216.8 U/mL 和 2 140.8 U/mL）的 1.1 倍。随着蔗糖添加量进一步提高至7%～9%，蛋白酶和果胶酶活力提高不明显。

根据结果分析，对于单菌株CICC 23083 发酵表达蛋白酶与果胶酶，3%酵母膏的促进作用要远大于5%蔗糖添加量。根据结果推测，高浓度植物皂素提取液可提供充足碳源为CICC 23083 表达双酶，但额外添加少量外援氮源（3%酵母膏）可显著促进该菌株表达双酶。

图1 酵母膏量对蛋白酶和果胶酶表达的影响

图2 蔗糖量对蛋白酶和果胶酶表达的影响

2.3 双菌株混合发酵

图3 酵母膏量对双菌株混合发酵产酶的影响

2.3.1 酵母膏的影响 在发酵基质分别加入3%、5%、7%、9%和11%的酵母膏用于CICC 21085 和CICC 23083 混合发酵，每8 h 取样测定3 种酶活力。从图3A 可以看出，脂肪酶活力峰值均在16 h 出现。当添加3%的酵母膏可获得最大脂肪酶活力，为166.7 U/mL，与CICC 21085 单菌株发酵表达脂肪酶所获最大酶活力相同，说明3%酵母膏添加量对双菌株混合发酵中的脂肪酶表达影响不明显。然而添加3%酵母膏发酵，蛋白酶活力在8 h 达到峰值（245.8 U/mL）（图3B），当酵母膏添加量大于3%时，蛋白酶活力均在发酵24 h 达到酶峰点，最大值为347.9 U/mL。关于果胶酶的表达（图3C），当发酵基质中添加5%酵母膏时，酶活力在8 h 达到最大值4 745.4 U/mL。添加酵母膏进行双菌株混合发酵，蛋白酶和果胶酶达到最大酶活力的时间缩短了8～24 h，但两种酶最大酶活力分别比CICC 23083 单菌株发酵所获最大酶活力降低了56.1%和提高了9.0%。根据结果推测，双菌株混合发酵表达三酶时，添加酵母膏对脂肪酶的表达（CICC 21085 发酵）没有明显影响，但对蛋白酶和果胶酶的表达量与表达时间（CICC 23083 发酵）都有显著影响。考虑到脂肪酶对去污效果影响最大，添加3%酵母膏进行的双菌株发酵能获得最大的脂肪酶活力，因此选择3%酵母膏作为双菌株发酵的最佳添加量。

2.3.2 蔗糖的影响 在基质添加3%酵母膏基础上，再分别加入1%、3%、5%和7%的蔗糖进行双菌株混合发酵，每8 h 取样测定脂肪酶、蛋白酶和果胶酶活力。如图4所示，添加7%的蔗糖作为底物发酵时，脂肪酶和蛋白酶分别在24 h 和32 h 获得最大酶活力，为133.3 U/mL 和327.4 U/mL。果胶酶也在发酵24 h达到活力峰值（图4C）。当蔗糖添加量为5%时，果胶酶获得最大酶活力为3 817.7 U/mL；而当蔗糖添加量为7%时，果胶酶活力最大值降低至3 318.2 U/mL。根据结果对比分析发现，与基质中添加3%酵母膏（基质+3%酵母膏）的发酵相比，基质添加3%酵母膏和7%蔗糖（基质+3%酵母膏+7%蔗糖）的发酵所获最大脂肪酶活力和果胶酶活力分别降低了20.0%和22.5%，而蛋白酶最大活力提高33.2%。

考虑到脂肪酶对产品去污力的影响作用要大于蛋白酶与果胶酶，因此，双菌株发酵表达三酶的最佳发酵条件为添加3%酵母膏，不需要进一步添加任何碳源。

2.4 洗涤效果比较

如图5 所示，枯草芽孢杆菌CICC 23083 和地衣芽孢杆菌CICC 21085 单菌株发酵液的相对去污力分别为84.8%和88.9%，比未发酵提取液的去污力（77.4%）分别提高了7.4 和11.5 个百分点。双菌株混合发酵液去污力最高视为100%，比未发酵皂素提取液去污力提高22.6 个百分点，比单菌株发酵液去污力分别提高11.1、15.2 个百分点。根据结果分析，酶对植物皂素提取液去污力的提升效果大小排序为脂肪酶+蛋白酶+果胶酶>脂肪酶>蛋白酶+果胶酶。研究结果表明，植物皂素提取液作为基质，通过添加3%的酵母膏进行双菌株混合发酵表达脂肪酶、蛋白酶和果胶酶，即可显著提升去污力。

图4 蔗糖量对双菌株混合发酵产酶的影响

2.5 泡沫高度

泡沫高度是由液膜隔开和并列的气泡形成的气泡群，是衡量表面活性剂质量且必须考察的重要性能之一。根据国家标准GB/T 29679-2013 规定，透明与非透明型洗涤类产品的泡沫高度底限分别为100 和50 mm。本研究所获高浓度皂素提取液（非透明）在发酵前后的泡沫高度基本没有明显变化，维持在（157±5）mm，是《化妆品安全技术规范》（2015 版）规定的非透明型产品泡沫高度底限的3 倍多，达到甚至略高于大部分市售透明型洗涤产品的起泡高度。经发酵后的皂素提取液泡沫高度不受影响是因为皂素浓度在发酵过程中没有变化。

图5 发酵液洗涤效果对比

3 结论

本研究以高浓度的植物皂素提取液为底物，对CICC 23083 和CICC 21085 发酵表达脂肪酶、蛋白酶和果胶酶的工艺条件进行优化，目的是为了提高皂素提取液的去污能力。结果表明，3%的酵母膏能显著促进枯草芽孢杆菌CICC 23083 表达蛋白酶和果胶酶，达到的最高酶活力分别是无酵母膏直接发酵的3.7 倍和2.0 倍。蔗糖对单菌株CICC 21085 表达脂肪酶有明显促进作用，但对单菌株CICC 23083 表达蛋白酶与果胶酶没有明显改善作用。利用双菌株混合发酵时，添加3%酵母膏可获得最大的脂肪酶活力（166.7 U/mL），但进一步添加7%蔗糖，最大脂肪酶活力和果胶酶活力分别降低20.0%和22.5%，而最大蛋白酶活力提高33.2%。

对发酵液的洗涤性能研究分析发现，双菌株混合发酵液去污力比未发酵皂素提取液去污力提高22.6个百分点，比单菌株发酵液去污力分别提高11.1～15.2 个百分点。酶对植物皂素提取液去污力的提升效果排序脂肪酶+蛋白酶+果胶酶>脂肪酶>蛋白酶+果胶酶。植物皂素提取液（非透明）在发酵前后的泡沫高度基本没有明显变化，维持在（157±5）mm，是国标规定的非透明型产品泡沫高度底限的3 倍多。试验为开发富酶的天然表面活性剂提供理论依据。