Box-Behnken 响应面法优化航天杂交构树叶多糖提取工艺及体外抗氧化活性研究

严 丹，蔡延渠，李铁程，陈必添，冯华仔，张志鹏

（1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.广东药科大学新药研发中心，广州 510006；3.阳江市金星种养产业研究院，广东 阳江 529500）

航天杂交构树（Broussonetia papyrifera）为桑科构树属多年生落叶乔木，是中国科学院植物研究所利用现代生物技术和传统杂交育种方法，采取基因工程、新种质创制和航天搭载诱变等技术培育出的多功能林木树种［1］。

中医认为，构树的乳液、根皮、树皮、叶、果实及种子均可入药；其中果实为中药褚实子，与根共入药，具有补肾、利尿、强筋骨之功效。但是，目前构树的价值多体现于纸张加工、饲料生产、园艺绿化等方面［2，3］，在药用方面的开发利用甚少，是一种尚未被深入研究和开发利用的可贵药用资源。现代研究发现，天然植物多糖具有抗肝损伤、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗氧化剂、免疫调节等多种生物活性［4］，可广泛应用于药品、食品、化妆品等方面［5，6］。但是目前尚无有关构树叶多糖及其抗氧化活性的研究报道。因此，本研究以航天杂交构树叶为原料，采用加热回流提取法，在单因素试验基础上，通过Box-Behnken响应面法进行多糖工艺优化；同时，体外测定DPPH自由基（DPPH·）、自由基阳离子（ABTS+·）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（·）的清除率及对铁的还原力，为构树叶多糖在医药保健、美容护肤等方面的开发利用提供依据，同时也为航天杂交构树品种的种植推广提供新动力。

1 材料与方法

1.1 试药

航天杂交构树叶样品由阳江市金星种养产业研究院提供，经广东药科大学新药研发中心吴燕红高级工程师鉴定为桑科构树属构树的叶。

D-无水葡萄糖（批号110833-201707，含量99.9%），中国食品药品检定研究院；维生素C（VC，批号 SLBN3833V），Sigma 试剂有限公司；D-半乳糖，上海源叶生物有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Thris）、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）、2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS），上海麦克林生化科技有限公司；邻苯三酚、氢氧化钠、苯酚、浓硫酸、氯仿、正丁醇、过硫酸钾、抗坏血酸（VC）、盐酸、无水乙醇、硫酸亚铁、过氧化氢、二水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠、铁氰化钾、水杨酸、三氯乙酸、氯化铁均为分析纯；水为实验室自制纯水。

1.2 仪器

UV-1700 双光束紫外分光光度计，日本岛津公司；EPED-10TF 纯水器，南京益普易达科技发展有限公司；FreeZone2.5 冷冻干燥机，美国Labconco 公司；LB940 多功能酶标仪，美国 BioTek 公司；BP-211D 电子分析天平，德国 Sartorius 公司；JJ1000Y 电子天平，美国双杰集团有限公司；RE-52 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；BHS-4 数显恒温水浴锅，江阴市保利科研器械有限公司；pHS-3C pH 计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 构树叶多糖的提取 将新鲜构树叶冲洗、烘干，粉碎，过20 目筛，得到构树叶粉末。取30 g 构树叶粉末，加入纯水，采用加热回流法提取，以不同的提取温度、料液比、提取时间、提取次数等为考察因素。提取液过滤，滤液于75 ℃减压浓缩至适量，加入乙醇至终体积为浓缩前的85%，冰箱4 ℃静置过夜后取沉淀冷冻干燥，即得构树叶多糖［7，8］。

1.3.2 单因素考察 以水为提取溶剂，考察不同提取温度（60、70、80、90、100 ℃）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL）、提取时间（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h）和提取次数（1、2、3、4 次）对构树叶多糖得率的影响。每次进行单因素试验时，固定其他因素，考察因素变化，3 次重复。

1.3.3 响应面优化设计 通过单因素试验结果，选择影响较为显著的因素，进行3 因素3 水平Box-Behnken 响应面试验设计。固定提取温度为100 ℃，以料液比为A因素、提取时间为B因素及提取次数为C因素，以多糖得率为响应值，采用Design-Ex⁃pert 8.0 软件进行二次回归方程拟合，优选构树叶多糖的最佳提取条件。因素与水平见表1。

表1 响应面法的因素与水平

1.3.4 多糖得率的测定 采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的D-无水葡萄糖标准溶液（0.103 6 mg/mL），补纯水至2 mL，加入1.0 mL 5%苯酚溶液、6.0 mL 浓硫酸溶液，沸水浴20 min，取出冷却至室温，于490 nm 处测定吸光度（A）。以D-无水葡萄糖质量浓度为横坐标（X）、吸光度A为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算构树叶多糖得率［9］。

构树叶多糖得率=构树叶多糖质量/构树叶质量×100%

1.3.5 体外抗氧化活性测定

1）清除DPPH·自由基能力测定。准确配制质量浓度为 0.35 mg/mL 的 DPPH 储备液，吸取 0.5 mL 加入1 mL不同浓度样品溶液（多糖溶液或VC溶液），混匀，室温下避光反应30 min，于517 nm 处测定吸光度A1；另吸取0.5 mL DPPH 储备液、1 mL纯水，同法测定吸光度A0；另吸取0.5 mL 无水乙醇、1 mL 样品溶液，同法测定吸光度值A2。按下式计算清除率［10，11］。

清除率=［1-（A1-A2）/A0］×100%

2）清除ABTS+·自由基能力测定。将7 mmol/L的ABTS 溶液和7.35 mmol/L 过硫酸钾溶液按体积比2∶1 混合，室温下避光反应 16 h 制备成 ABTS 储备液，用前稀释至波长734 nm 处的吸光度A0为0.70±0.2。分别吸取1 mL 不同浓度样品溶液（多糖溶液或VC 溶液）和2 mL ABTS 稀释液，超声30 s，室温下避光反应10 min，于波长734 nm 处测定吸光度A1。按下式计算清除率。

清除率=（A0-A1）/A0×100%

3）清除·OH 自由基能力测定。吸取不同浓度样品溶液（多糖溶液或VC 溶液）、6 mmol/L FeSO4溶液及6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混匀后静置10 min；再加入2 mL 6 mmol/L 水杨酸溶液，静置30 min，于波长510 nm 处测定吸光度A1；以纯水代替水杨酸，同法测定吸光度A2；另以纯水为空白，同法测定吸光度A0。按下式计算清除率。

清除率=［1-（A1-A2）］/A0×100%

清除率=［1-（A1-A2）］/A0×100%

5）铁还原力测定。吸取1 mL 不同浓度样品溶液（多糖溶液或VC 溶液），加入1%铁氰化钾溶液与磷酸缓冲液（pH 6.6）各2.5 mL，50 ℃水浴20 min，取出冷却至室温；再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混匀，3 500 r/min 离心 15 min，取上清液 2.5 mL，加入0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液和2.5 mL 纯水，20 min后于波长700 nm 处测定吸光度。同时以纯水为空白、VC 为阳性对照测吸光度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以D-无水葡萄糖质量浓度为横坐标（X）、A为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y=0.066 5X+0.006 14，r=0.999 2，结果显示在 2.302 2～11.511 1 μg/mL 线性关系较好。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取温度对构树叶多糖得率的影响 以料液比1∶30（g/mL）、提取时间2 h、提取1 次为固定因素，考察提取温度对构树叶多糖得率的影响。由图1 可知，构树叶多糖得率随着提取温度（60～100 ℃）的提高而升高，以100 ℃时最高，得率为5.57%。由于水溶剂在常压下的沸点温度为100 ℃，因此选择最佳提取温度为100 ℃。

图1 提取温度对构树叶多糖得率的影响

2.2.2 料液比对构树叶多糖得率的影响 以提取温度100 ℃、提取时间2 h、提取1 次为固定因素，考察料液比对构树叶多糖得率的影响。由图2 可知，构树叶多糖得率在一定范围内（1∶10～1∶40 g/mL）随着溶剂的增加而增大，当料液比为1∶40～1∶60 g/mL时，多糖得率趋于稳定，无明显变化，表明多糖已基本溶出。

图2 料液比对构树叶多糖得率的影响

2.2.3 提取时间对构树叶多糖得率的影响 以提取温度100 ℃、料液比1∶40、提取1 次为固定因素。由图3 可知，提取时间在0.5～2.0 h 构树叶多糖的得率明显增加，2.0～3.0 h趋于平缓，无明显变化；4.0 h后稍微下降，可能是由于提取时间过长，杂质溶出较多，从而影响多糖得率，因此选择最佳提取时间2.0 h。

2.2.4 提取次数对构树叶多糖得率的影响 以提取温度 100 ℃、料液比 1∶40、提取时间 2.0 h 为固定因素，考察提取次数对构树叶多糖得率的影响。由图4 可知，当提取次数增加，构树叶多糖得率可随之增加；但提取2 次之后得率增加不明显，逐渐趋于稳定。由于提取次数过多，导致溶剂用量增多、耗能增大，因此选择最佳提取次数为2 次。

图3 提取时间对构树叶多糖得率的影响

图4 提取次数对构树叶多糖得率的影响

2.3 响应面试验

2.3.1 试验结果 响应面试验结果见表2。

2.3.2 回归模型与方差分析 采用Design Expert 8.0 软件对数据进行多元回归拟合，得到构树叶多糖得率（Y）对3 因素的回归方程：

Y=8.07+0.29A+0.24B+1.05C-0.088AB-0.095AC-0.14BC-0.32A2-0.13B2-0.90C2。

由表3 结果可知，模型F为 748.97（P<0.000 1）、失拟项值为2.51（P>0.05），表明该模型显著且拟合度良好，同时相关系数R2为0.999 0 及失拟项系数为0.997 6，表明试验操作可信，理论预测可行。另外，由F可知，因素A、B、C及其交互项AB、AC、BC与二次项A2、B2、C2对构树叶多糖得率均表现出极显著性影响（P<0.01），顺序依次为C>A>B。

2.3.3 响应面分析 通过模型绘制各因素的响应面与等高线（图5），分析提取过程中不同因素的相互作用对构树叶多糖得率的影响，由图5 可知，料液比与提取时间、提取次数的响应面较陡峭、等高线趋于椭圆形，表明3 个因素间交互作用显著。其中，随着溶剂的增加，构树叶多糖得率先增加后稳定；随着提取时间的延长、提取次数的增加，构树叶多糖得率均先增加后略微下降。

表2 响应面试验设计与结果

表3 回归模型方差分析结果

2.3.4 最优条件确定 由软件分析所得最优提取工艺条件为料液比1∶43.03（g/mL），提取时间2.57 h、提取2.52 次，预测构树叶多糖得率的理论值为8.45%。结合实际情况修正为料液比1∶40（g/mL）、提取时间2.5 h、提取3次，该条件下多糖得率为（8.37±1.03）%，与理论预测值较为接近。

2.4 体外抗氧化活性评价

2.4.1 清除DPPH·作用 对DPPH·自由基清除率变化曲线进行线性回归得到方程：构树叶多糖Y=2.450X+43.57（R2=0.989），IC50为 2.62 mg/mL；VCY=2.285X+37.08（R2=0.988），IC50为 5.64 mg/mL。在 1～10 mg/mL 随着浓度的增加，构树叶多糖对DPPH·自由基的清除作用逐渐增强，且强于VC（图6）。

图5 不同因素交互作用对构树叶多糖得率影响的响应面与等高线

图6 不同样品对DPPH·自由基清除作用

2.4.2 清除ABTS+·自由基 对ABTS+·自由基清除率变化曲线进行线性回归得到方程：构树叶多糖Y=702.1X+2.724（R2=0.982），IC50为 0.067 mg/mL；VCY=1 654.0X+26.29（R2=0.991），IC50为 0.014 mg/mL。在0.04～0.14 mg/mL 随着浓度的提高，构树叶多糖对ABTS+·自由基的清除作用逐渐增强，表明具有较强的清除作用，但弱于VC（图7）。

2.4.3 清除·OH 自由基 对·OH 自由基清除率变化曲线进行线性回归得到方程：构树叶多糖Y=21.09X+30.17（R2=0.986），IC50为 0.94 mg/mL；VCY=112.80X+18.66（R2=0.986），IC50为 0.28 mg/mL。在0.1～2.5 mg/mL 随着浓度的提高，构树叶多糖对·OH自由基的清除作用逐渐增强，表明具有较强的清除作用，但弱于VC（图8）。

图7 不同样品对ABTS+·自由基清除作用

图8 不同样品对·OH 自由基清除作用

图9 不同质量浓度样品对·自由基清除能力

2.4.5 对铁的还原力测定 由图10 可知，在0.08～0.48 mg/mL 构树叶多糖与VC 的还原力均随质量浓度的增大而提高，但是VC 的增幅更大；两者相比，VC 还原力强于构树叶多糖。

3 结论

采用加热回流提取构树叶多糖，通过Box-Behnken 响应面法进行优化，同时进一步修正得到最佳提取工艺为提取温度100 ℃、料液比1∶40（g/mL）、提取时间2.5 h、提取3 次，该条件下所得多糖得率为（8.37±1.03）%，稍低于理论值；表明模型具有较好的预测性，该优化的工艺参数切实可行，适用于构树叶多糖提取工艺的优化。

图10 不同样品的还原能力

体外抗氧化活性结果表明，构树叶多糖具有较强的清除DPPH·、ABTS+·、·OH 和·等自由基的活性，其中对DPPH·的作用强于VC，其他则弱于VC；对铁的还原力与抗氧化能力表现出正相关性，且均呈现出良好的量效关系。构树叶多糖可作为医药保健食品、美容护肤品等的新型天然抗氧化剂，其作用途径及相关通路将进一步深入研究。