2，4-表油菜素内酯对紫花苜蓿高温胁迫生理特性的影响

黄一龙，庞天德，史 静，韦锦益，姚 娜

（广西壮族自治区畜牧研究所，南宁 530001）

广西地处中国南方亚热带季风气候区，水热同期，年均温大于等于10 ℃，具有良好的植物生长条件优势。但每年从5 月开始进入高温高湿气候，致使很多暖温带地区生长的优质牧草如苜蓿、黑麦草、紫云英等不能越夏，在广西地区只能作为冬季牧草使用，使用时间短，每年都需要重复种植，极大地提高了种植成本，降低了使用效率。

大量的研究表明，植物的耐热性与其自身代谢具有很大的关系［1］。高温条件下，植株体内会发生一系列生理变化，渗透调节能力降低，细胞活性氧的产生与清除平衡被打破，抗氧化酶防御系统以及光合系统均会发生一系列变化，对植物的生长发育造成很大影响，甚至死亡［2-4］。近年来，应对植物的高温胁迫，除了筛选耐高温品种以外，外源保护剂的应用对热应激下的植物生长也具有积极作用［1］。油菜素内酯（Brassinolide，BR）是甾醇类植物生长激素，活性高，具有较强的广普性，现已被确认为第6 类植物激素［5］。对植物逆境胁迫高温、干旱、高盐以及病害等具有抗性作用，能增强细胞的分裂和伸长，促进作物生长，增强光合作用，提高生物产量，调节植物的生理代谢功能，提高抗逆性，保护植物免受逆境胁迫［6］。2，4-表油菜素内酯（2，4-Epibrassinolide，EBR）作为人工合成的高活性油菜素内酯类似物，被广泛地应用于农业生产［6，7］。在茶树［7］、水稻［8］、花卉牡丹［5］、除虫菊［9］以及番茄［10］、茄子［11］、龙须菜［12］、西葫芦［6］等蔬菜应对高温胁迫的研究中有较多应用，但在紫花苜蓿的耐热性研究上鲜见报道。为此，试验运用外源激素2，4-表油菜素内酯对高温胁迫下的紫花苜蓿（Medicago sativaL.）进行抗高温胁迫机理研究，探索外源激素调控紫花苜蓿的抗逆生理机制，提高抗热性，降低高温损害，延长南方冬季型牧草的使用寿命，提高利用效率，以期解决暖温带的优质牧草在南方畜牧业的应用及生产上的局限性问题。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验选择紫花苜蓿WL525 为试验材料，购于百绿（天津）草业有限公司。将紫花苜蓿栽种于花盆中，待长至3 个月苗龄时，选取长势基本一致的苜蓿幼苗放入人工气候箱，置于人工智能气候箱中模拟高温环境胁迫。预培养15 d，光照度3 000 lx，昼/夜温度25 ℃/15 ℃，湿度80%，光照12 h，黑暗12 h。试验设 0（对照）、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L 5 个梯度外源激素EBR浓度，其中对照喷施无菌水。1周后进行叶面喷施外源激素处理。连续喷施3 d，第3 天喷施结束2 h 后，将温度调节至昼/夜温度42 ℃/30 ℃，光照、湿度及光照时间相同，分别于 0、3、6、12、24 h 后取样（成熟叶片），放入液氮中速冻，再转入-40 ℃冰箱保存备用，检测样本的脯氨酸含量、可溶性蛋白质含量、过氧化物酶（POD）及超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.2 生理指标测定

脯氨酸用磺基水杨酸溶液提取后，采用茚三酮比色法［13］进行测定；可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝比色法［13］测定；POD 活性采用愈创木酚法［13］测定；SOD 活性采用氮蓝四唑NBT 法［13］测定。

1.3 统计与分析

试验数据以（平均值±标准误）表示，利用Excel软件建立原始数据库并制图表，采用DPS 13.5 软件对数据进行显著性检验和多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫下EBR 对紫花苜蓿游离脯氨酸含量的影响

随着高温胁迫时间的延长，不同处理的紫花苜蓿游离脯氨酸含量均呈上升趋势。其中0.10 mg/L EBR 处理下游离脯氨酸含量上升最快，24 h 达到（59.85±10.65）μg/g，较对照提高了54.25%，其次为0.50 mg/L EBR 处理，24 h 游离脯氨酸含量为（57.55±7.50）μg/g，较对照提高了48.32%（图1）。

图1 EBR 对高温胁迫下紫花苜蓿游离脯氨酸的影响

2.2 高温胁迫下EBR 对紫花苜蓿可溶性蛋白质含量的影响

高温胁迫下，紫花苜蓿对照组可溶性蛋白质含量呈先上升后下降的变化趋势。但随着EBR 的施用，可溶性蛋白质含量在先上升再下降后又呈逐渐回升的趋势，0.10 mg/L EBR 处理分别在 3、6、12 和24 h时均处于最高值，其中在12 h时达到28.55 mg/g，较对照组提高59.68%，差异显著（P＜0.05）（图2）。

图2 EBR 处理对高温胁迫下紫花苜蓿可溶性蛋白质含量的影响

2.3 高温胁迫下EBR 对紫花苜蓿抗氧化代谢指标的影响

在高温胁迫下，不同浓度EBR 处理紫花苜蓿使其对抗氧化酶活性指标呈现不同程度的变化。从POD 活性的变化规律来看，在高温胁迫下3 h 内POD 指标具有较高活性，呈上升趋势，随着胁迫时间的延长活性逐渐降低。但在相同时间内，EBR 处理能够显著提高POD 活性，其中，0.10 mg/L EBR 处理在高温胁迫下POD 活性较对照提高了15.38%～63.99%（图3）。从SOD 活性的变化规律来看，高温胁迫下，紫花苜蓿SOD 活性呈先上升后下降的趋势。在高温胁迫处理0、3、6 h时，0.10 mg/L EBR 处理具有明显优势，较对照组高出22.69%～38.66%；随着高温胁迫处理时间的延长，12 h 和24 h 时，0.05 mg/L EBR 处理产生的SOD 活性最高，分别较对照高出15.64%和14.41%。

图3 EBR 处理对高温胁迫下紫花苜蓿POD 活性的影响

图4 EBR 处理对高温胁迫下紫花苜蓿SOD 活性的影响

3 小结与讨论

夏季高温是直接影响紫花苜蓿生长发育的主要生态环境因素之一。在高温的胁迫下，紫花苜蓿生长发育受阻，体内物质运输与光合系统遭受破坏，多个抗氧化酶活性下降，生理代谢失衡，抗旱、抗病虫害的能力也随之下降［14，15］。高温再伴随着病虫害的发生，紫花苜蓿就会生长缓慢，枯萎甚至死亡。紫花苜蓿在受到高温胁迫后，自身也会对胁迫产生一系列的应对反应，主要体现在细胞膜系统、渗透调节系统、抗氧化系统和光合系统 4 个方面［4，15］。其中，脯氨酸作为植物的渗透调节物质，主要起到平衡原生质与环境的渗透功能，保持植物膜结构的完整性，在正常情况下含量较少，但会随着外来胁迫逐渐积累，对植物的渗透调节系统进行保护，是抵御外界胁迫的重要信号之一。试验中，喷施EBR 溶液使紫花苜蓿体内的游离脯氨酸含量较对照有明显提升，且随着胁迫时间的延长呈上升趋势，喷施浓度为0.10 mg/L效果最佳，由此可见，喷施EBR 溶液可以在高温逆境中促进脯氨酸的积累，改善细胞膜透性，与王震等［6］在2，4-表油菜素内酯应对高温胁迫下的西葫芦幼苗生理及光合特性研究以及高健等［8］在2，4-表油菜素内酯缓解水稻花期高温胁迫的生理机制研究中结果一致。

可溶性蛋白质也是植物在逆境中应对胁迫的重要标志之一。它具有较强的亲水力，随着胁迫大量产生，保护细胞膜，明显增加细胞亲水力、原生质弹性以及束缚水含量，调节平衡细胞与环境的渗透压，从而缓解高温等对植物的伤害［16，17］。本试验中，外源EBR 对紫花苜蓿可溶性蛋白质的累积具有显著的作用效果，且随着胁迫时间的延长差异明显，说明外源EBR 能够通过迅速积累提高可溶性蛋白质含量，增加紫花苜蓿的细胞渗透调节作用，提高植物的抗高温能力。这与吴雪霞等［11］在外源EBR 对高温胁迫下茄子幼苗生长中可溶性蛋白的研究以及任增斌等［5］在外源EBR 对于牡丹耐热性中可溶性蛋白质的研究结果一致。

高温胁迫下，植物细胞内会产生大量的自由基，脂膜发生过氧化现象，正常的生理代谢功能遭受损害［4］。此时，植物会通过一定的酶学机制来抵御或修复逆境对细胞所造成的伤害，从而保护植物体的正常生长。其中过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等就可以通过调节其活性，来清除高温胁迫所带来的过剩自由基和活性氧，保护自身细胞免受氧化伤害。而通过外源激素EBR的处理，能够进一步的提高POD 和SOD 的活性，缓解高温胁迫所带来的伤害，在李志鑫等［7］利用外源激素EBR 诱导茶树耐热性生理机制研究和华智锐等［18］在小麦幼苗抗旱性的诱导效应研究结果中均可以看出。本试验中EBR 对高温胁迫下紫花苜蓿的POD 和SOD 活性均较对照有明显的提高，且保持较高的活性程度，说明EBR 对高温胁迫下的紫花苜蓿酶反应机制敏感，且效果比较理想，缓解了高温胁迫对紫花苜蓿的伤害。

综合分析来看，外源2，4-表油菜素内酯作为一种高活性的植物激素，对高温胁迫下的紫花苜蓿具有一定的保护作用，能够降低高温对紫花苜蓿渗透调节系统和抗氧化系统的伤害，提高紫花苜蓿的耐热性，其中以0.10 mg/L 效果最好，为紫花苜蓿的抗高温栽培提供了基础理论依据。