正交实验优化玉液汤煎膏剂中葛根素和总皂苷提取工艺及制备工艺的研究*

韩瑞伟，张彦雨，何 礼，田 明，冯月男**

（1.四川中医药高等专科学校 川西北药用资源与利用实验室，四川 绵阳621000；2.黑龙江中医药大学 附属第二医院，黑龙江 哈尔滨150040）

前 言

糖尿病是因胰岛素分泌相对或绝对不足所导致的一种复杂且特异的代谢性临床综合征[1]。近年来糖尿病的发病率迅速升高，国际糖尿病联盟2019年调查结果显示，全球约有4.63亿糖尿病患者，中国约有1.16亿成年人患有糖尿病且面临罹患危及生命的并发症的风险，严重危害人民健康和生存质量[2～4]，同时，给个人以及家庭带来沉重的经济负担。现代医学治疗糖尿病强调疾病的微观区分，通过症状和检查确定疾病类型，探索致病因素，准确定位致病器官并始终以相同的方式治疗相同的疾病，在治疗糖尿病方面，主要集中在血糖调节，但很少考虑高血糖的病因。相反，中医药在治疗糖尿病时强调辨证论治，着重于整体观念，并考察症状和造成疾病的原因，中医中药在预防和治疗糖尿病方面经验丰富，有整体调节、综合治疗且毒副作用小等优势[5]。玉液汤出自张锡纯所著《医学衷中参西录》，是治疗消渴的名方，现代药理学实验及临床观察均证实其对糖尿病具有良好疗效[6～10]。

随着现代技术的快速发展，玉液汤临床仍以传统煎煮服用形式为主，虽是最经典的制备方法，但对于需长期服药的糖尿病患者，具有服用量大，储存和携带不便等缺点。中药煎膏剂从提取工艺到服用方式，即保留了原方用药特点，又能发挥现代剂型的优势[11～13]，具有剂量小、口感佳，质量可控等优点，同时煎膏剂的制备工艺较其他剂型来说较为简便[14]，为使其更好应用于临床，拟在中医理论的基础上开发玉液汤煎膏剂，本文主要研究玉液汤煎膏剂提取、浓缩和成型工艺，为进一步研究与生产提供依据。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

黄芪、山药、知母、鸡内金、葛根、五味子、天花粉饮片（亳州市瑞辉医药有限公司，批号均为：20180301，经鉴定符合《中国药典》2015版一部要求）；黄芪甲苷对照品（上海宝曼生物科技有限公司）、葛根素对照品（上海宝曼生物科技有限公司）；木糖醇（大连美仑生物技术有限公司）；甲醇（格里斯医药化学技术有限公司，色谱纯）；甲醇（格里斯医药化学技术有限公司、分析纯）、乙醇（天津市大茂化学制剂厂）、高氯酸（天津市福晨化学试剂厂）、冰醋酸（常州恒光化学试剂有限公司）、氯仿（洛阳昊华化学试剂有限公司）；超纯水。

1.2 仪器与设备

名称高效液相色谱仪紫外-可见分光光度仪多功能提取罐电热恒温水浴锅电子天平分析天平数显控温电热套电热恒温减压干燥箱超声波清洗仪厂家美国Waters日本岛津湖南合信制药设备有限公司上海一恒科学仪器有限公司上海蒲春计量仪器有限公司赛多利斯科学仪器有限公司北京市永光明医疗仪器有限公司上海一恒科学仪器有限公司深圳市超洁实业科有限公司型号Waters1515 UV-2550 DGQ-6m3 HWS-12 JEA102 BSA224S SXKW DHG-9030A CJ-060-3

2 方法与结果

2.1 处方的确定

玉液汤原方（《医学衷中参西录》记载）按照现代单位换算，确定现代处方用量，即：山药30g，知母18g，黄芪15g，五味子9g，天花粉9g，鸡内金6g，葛根5g[15]。

2.2 提取工艺研究

以预实验结果为参考标准采取回流提取的方法，将出膏率、醇浸出物、总皂苷和葛根素含量作为评价指标（以下简称“四要素”），从加水量、浸泡时间、提取次数、提取时间四方面对药材的提取工艺进行考察，以选择最优提取方案。

2.2.1 浸泡时间考察

玉液汤总药材量为92g，按处方量的1/10量取药材8份，即每份9.2g，每份加10倍量水，将药材浸泡时间设梯度，在10～100min之间每10min取一份药材、滤过，计算不同浸泡时间药材的吸水率。结果见图1。

图1浸泡时间与吸水率结果Fig.1 The results of soaking time and water absorption

结果显示，玉液汤中药材随浸泡时间增加吸水率呈上升状态，直到浸泡80min后吸水率不再上升，呈吸水饱和状态，故将玉液汤的浸泡时间选为80min。

2.2.2 正交设计优化提取工艺

根据玉液汤煎膏剂提取工艺的主要影响因素，选择正交设计对提取工艺进行优化，考察因素和水平如表1所示。

表1玉液汤煎膏剂提取工艺的正交设计Table 1 The orthogonal design of extraction process of Yuye decoction agent

处方量药材，按照上述表格对应各因素水平，每项首次加水时浸泡80min，按设计次数进行回流提取并收集提取药液，浓缩，定容置200mL，测出膏率、醇浸出物、总皂苷含量和葛根素的含量。

2.2.3 指标成分的测定[16]

（1）出膏率的测定：精确量取100mL“2.2.2”项下玉液汤提取液，按加水量设计方案每个因素水平量取一份后分别置于蒸发皿中蒸干，蒸干后置于烘箱中干燥至恒重，最后将其置于干燥器干燥30min后迅速称重，计算出膏率。将所得干燥药品研细，用于下一步研究。

（2）醇溶浸出物的测定：称取3.5g上一步干燥药粉，将其溶于95%乙醇中，按照《中华人民共和国药典》醇溶性浸出物测定法（通则2201）测定，得醇溶浸出物含量。

（3）总皂苷含量的测定[17]

供试品A溶液的制备：精确称取“2.2.2”项下玉液汤三个因素水平的提取液，每个因素一份，每份100mL，分别置于分液漏斗中每次50mL氯仿萃取，共三次。将萃取所得药液用蒸发皿蒸干，药渣置于具塞锥形瓶中加入25mL水饱和正丁醇，超声60min，抽滤，再将滤液蒸干后加10mL水溶解残渣，残渣上D101大孔吸附树脂柱，按照50mL水洗脱、50mL 70%乙醇顺序洗脱，收集洗脱液，将其置于水浴锅上蒸干，残渣用2mL甲醇溶解后定容至5mL，混匀，即为供试品溶液。

对照品B溶液的制备：黄芪甲苷对照品经精密度为1/100000的分析天平精密称取，用甲醇溶解成浓度为0.5mg/mL的溶液，即得。

选择测量波长及测定吸光度值[18]：将50μL A溶液和50μL B溶液分别置于具塞试管中，挥干溶剂后加0.3mL 5%冰醋酸和0.7mL高氯酸，盖塞密闭，用60℃水浴锅加热20min，取出冷却，加冰醋酸5mL，使用全波长紫外-可见分光光度计扫描测定。二者均在560nm处有最大吸收，故将560nm设为测定波长，计算总皂苷含量。

（4）葛根素含量的测定[19]

色谱条件：色谱柱:Lichrospher-C18（4.6×150mm，5μm）柱；流动相:甲醇-0.4%醋酸溶液（26∶74）；流速:1mL·min-1；柱温:30℃；检测波长:250nm。

对照品C溶液的制备：用精密度为1/100000的分析天平精密称取葛根素对照品加35%乙醇制成50μg/mL的溶液，即得对照品C溶液。

供试品D溶液的制备：取1g“2.2.3”项下备用干膏研细，加50mL 35%乙醇，称重，超声20min，再次称重，用35%乙醇补足缺少质量，抽滤，即得。

测定方法：10μL C溶液和10μL D溶液分别进高效液相色谱仪测定分析。

2.2.4 正交试验设计及结果

表2玉液汤煎膏剂提取工艺正交设计结果表Table 2 The orthogonal design results of Yuye decoction agent extraction process

正交试验结果显示，以出膏率为标准的最佳提取条件为A2B3C3条件组合；以浸出物为标准的最佳提取条件为A2B3C3组合；以总皂苷为标准的最佳提取条件为A2B3C3组合；以葛根素为标准的最佳提取条件为A3B3C3组合。

德国哲学家康德在1781年首次提出了图式的概念。1932年英国心理学家巴特利特提出“图式”在心理学中的定义。随后，教育家皮亚杰，鲁姆哈特，Carrell，Nunan等人的研究奠定了图式理论的理论基础。这些理论基础被广泛应用于后来的研究中。

从试验结果可知，综合考虑加水量、提取次数和提取时间对玉液汤煎膏剂的四要素的影响，最终选取最优提取工艺为A2B2C3组合，即10倍水量回流提取120min、8倍回流提取90min，共两次，将两次提取液合并，供下一步使用。

2.3 浓缩工艺研究

依据煎膏剂的用量及其规格，最终确定将提取物浓缩至25mL。在该实验中，将出膏率、醇浸出物浓度和总皂苷含量作为研究指标，考察常压和减压下不同温度、温度相同不同压力下对指标的影响，选择最佳浓缩工艺。

2.3.1 相对密度测定

按照《中华人民共和国药典》相对密度测定法（0601）进行测定。

2.3.2 供试品溶液制备

10倍量处方药材，按照正交试验确定的最佳提取条件，即10倍水量回流提取120min、8倍回流提取90min进行提取，收集提取液，备用。

2.3.3 常压浓缩考察

2.3.4 减压浓缩考察

压力相同温度不同的考察：量取4份供试品溶液各650mL，减压0.09MPa，分别在温度60℃、70℃、80℃、90℃条件下浓缩至25mL。测出膏率、醇浸出物和总皂苷含量、相对密度。

同温度不同压力考察：3份上述药材，温度70℃、在压力分别为0.07、0.08、0.09MPa时进行浓缩，浓缩25mL。测定出膏率、醇浸出物、总皂苷含量，相对密度。

结果表明，压力在0.09MPa下，温度在60～90℃条件下，90℃时的出膏率、浸出物、总皂苷的含量略高于60～80℃时的，但差异不显著；温度70℃，压力0.07～0.09MPa对于出膏率、浸出物、总皂苷的含量影响很小，差异不显著。因此，实际生产中，可以采用常压90～100℃，或在减压0.07～0.09MPa、温度60～90℃条件下浓缩，相对密度不低于1.22。

2.4 矫味剂的筛选与用量

因玉液汤中药材味多酸、苦，故浓缩液味道欠佳，需加矫味剂改善口感。综合多方面考虑，选择阿斯巴甜、木糖醇和三氯蔗糖三种矫味剂，分别加入1%煎膏量的矫味剂，其中木糖醇口感最好。接下来又对木糖醇的用量进行考察，分别添加了12.5%、22.2%、30.0%、36.4%的木糖醇，结果显示以木糖醇含量30.0%、36.4%口感最佳，但36.4%的流动性较差，故选用含量为30.0%。

2.5 制剂处方和工艺确定

玉液汤一个处方药材重92g，一个处方可制备煎膏剂50mL，一日服用2次，即每次服用25mL，按1000个制剂单位（即1000mL）规范确定处方，即20倍原方药材回流煎煮两次，分别为加入10倍水量、浸泡80min、回流提取120min和加入8倍水量回流提取90min，将两次药液合并，采用常压90～100℃，或在减压0.07～0.09MPa、温度60～90℃条件下浓缩，相对密度不低于1.22，加入处方量30%的木糖醇，加适量水至1000mL，混匀，灌装，灭菌，即得。

3 结论

本课题在优选玉液汤煎膏提取工艺时，为了保证药材提取效果，对浸泡时间采取单因素试验进行考察，确定了浸泡时间为80min；以出膏率、浸出物、总皂苷含量和葛根素含量作为综合评价指标采取正交实验法进行考察，确定了最优提取工艺为10倍水量回流提取120min、8倍回流提取90min，共两次，将两次提取液合并；对常压和减压下不同温度、温度相同不同压力对指标的影响进行了系统的研究，最终确定了常压90～100℃，或在减压0.07～0.09MPa、温度60～90℃条件下浓缩；对三种矫味剂进行了用量考察，最终选用木糖醇做甜味剂，含量为30.0%。实验确定了玉液汤煎膏剂的最佳制备工艺，取得了一些积极的成果，但还有许多不全面的地方，对于其质量标准和稳定性的研究还应进一步完善，从而使玉液汤煎膏剂拥有更广阔的市场。