基因突变与α-突触核蛋白在帕金森病的研究进展

胡春波， 杨 颖， 孙江萌综述， 沈丽华审校

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是目前世界第二大神经退行性疾病。PD是由黑质致密部的多巴胺能神经元大量丢失和α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)聚集形成路易小体(Lewy Body,LBS)和路易神经纤维(Lewy Neurites)为特征的病变[1]。Spillantini等人于1997年发现α-syn淀粉样纤维是导致PD发生的毒性物质；最近的研究证实，α-syn在聚集初始阶段形成有毒性的寡聚体是导致PD细胞死亡的神经毒性物质[2]，提示α-syn在疾病的发生和发展中起着重要的作用。目前已发现的与PD发病相关的基因有20多个(见表1)。SNCA、LRRK2和VPS35的常染色体显性突变和PINK1、DJ-1和Parkin的常染色体隐性突变导致PD具有高外显性。表中所示各基因在细胞内的定位及功能不同，如parkin、PINK1、DJ-1存在线粒体，参与线粒体相关的应激反应,突变会导致受损的线粒体清除障碍，进而导致α-syn的聚集[3]；LRRK2的存在与溶酶体、内溶酶体及自噬途径相关，LRRK2突变增加了α-syn聚集[4]；VPS35介导囊泡的运输，其异常突变，增加α-syn错误折叠和毒性[5]。表2列出了这几个基因与PD相关的突变。我们将对以上SNCA、PRKN、PINK1、DJ-1、LRRK2和VPS35基因与α-syn的关系以及相互作用机制的最新进展作相关综述。

1 α-syn的结构和致病机制

1.1 α-syn的结构 SNCA基因编码的α-syn是一种14 kDa的蛋白分子，可分为3个主要区域：两亲水性的N-末端(1-60)、疏水性中心非淀粉样成分(61-95)和酸性C-末端(96-140)。N-端是由 7个重复的 11个赖氨酸残基组成的区域，形成两个α-螺旋、3个转角，目前所有已知的与α-syn相关的病理性突变均发生在该区域[6]，该区域可能还在突触小泡运输过程起作用[2]。其次，α-syn的C-末端结构域由许多带电荷的氨基酸残基组成的酸性不规则卷曲结构，该区域包含大多数翻译后修饰位点，还介导α-syn与其他蛋白质、配体和金属离子的相互作用。而中心区域非淀粉样成分，形成核心，这个区域是淀粉样的，负责蛋白质聚集。α-syn存在一个天然的未经折叠的三级结构，并且α-syn呈α-螺旋折叠的四聚体结构是天然构象，未折叠的单体是α-syn在脑中主要的生理存在形式。可溶性寡聚体(原纤维)是由两个或以上的α-syn单体的聚集形成的，是纤维和包涵体形式的中间体，最初蛋白的错误折叠，经过多级反应过程后，导致寡聚体的形成并进一步形成纤维和包涵体。α-syn亚型在PD中也有不同的表达，异构体α-syn-98聚集体被注射到小鼠黑质后，可显著提高内源性α-syn的磷酸化水平，α-syn的积聚与泛素结合蛋白p62和泛素共定位，其病理表现出与人Lewy Body相似的特性[7]。

1.2 α-syn致病机制 目前多数人认为PD的患病可能与基因突变导致的α-syn的自身聚集以及聚集早期形成的寡聚体有关[8]。1997 年Polymeropoulos等人发现α-syn首个突变A53T，为α-syn第 53 位氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸，会导致编码的α-syn由原先α-螺旋结构变成新的β-片层结构，导致其降解障碍，α-syn发生聚集。另外，A30P则是α-syn第 30 位氨基酸由丙氨酸变为脯氨酸,以及E46K、A53E突变都会导致α-syn的错误折叠。而G51D突变是唯一一个导致α-syn聚集风险降低的。目前α-syn导致PD的机制尚不完全清楚，α-syn寡聚体和纤维哪一个毒性更大仍需要研究。2011年Winner等人，通过上调体内寡聚体，发现其对细胞和线粒体的毒性较上调纤维的毒性更大[2]。据报道，异常聚集的α-syn可能存在于线粒体内，也可能位于线粒体外膜影响其结构和功能[9]，具有许多不同的致病作用，包括细胞骨架改变；膜通透性(线粒体、内质网、囊泡)；增加Ca2+内流；增加活性氧(Reactive Oxidative Species,ROS)的产生；以及突触毒性，表现为神经元兴奋性降低和突触放电减少[10]。寡聚体还损害自噬-溶酶体和泛素-蛋白酶体系统，已经报道了不同寡聚体的不同毒性机制，其中一些破坏了脂质双层，细胞通透性增加，从而导致离子内流增加；而另一些则直接进入细胞并导致蛋白质聚集增加[10]。

2 Parkin和PINK1基因突变与α-syn三者通过影响线粒体自噬导致线粒体应激反应

Parkin基因，定位于染色体6q25.2-q27，含有12个外显子，编码的Parkin蛋白含465个氨基酸。目前发现Parkin基因突变会导致其功能丧失(见表2)，不能正常降解底物。Parkin敲除小鼠早期多巴胺能神经退行性病变和运动缺陷的发生被促进，但并未使病理恶化[11]。PINK1基因，定位于染色体1p36，包含8个外显子，全长1.8 kb，编码的PTEN诱导激酶1，位于线粒体膜上，与Parkin基因编码的E3泛素连接酶共同作用线粒体，参与线粒体自噬[12]。在 2008 年的一项研究中，观察到解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)处理后，大量Parkin从胞浆移位到受损的线粒体，通过磷酸化激活Parkin，线粒体随后通过自噬方式去除。最近，在Parkin基因敲除小鼠中也发现在其DA神经元中，线粒体破碎，内部结构异常积累[13]。Parkin介导的受损线粒体清除途径需要PINK1，涉及Parkin-α-syn相互作用和泛素化，这些发现将这3个关键的PD基因与线粒体应激反应中的线粒体结构异常联系起来。在PD患者中，α-syn过表达会引起线粒体复合体I活性下降和ROS生成增加，导致线粒体应激。线粒体损伤时的膜电位(ΔΨm)减少，导致PINK1通过线粒体膜外的自动磷酸化积累和激活，该磷酸化位点在哺乳动物细胞的研究表明，PINK1可以在残基S228和S402处自动磷酸化，而在果蝇中S346残基上是唯一的PINK1自动磷酸化位点[14]。磷酸化之后可进一步阻止依赖ΔΨm的PINK1进入线粒体内部隔室，而此时，Parkin会迅速移位到线粒体，通过PINK1和Parkin泛素化调节线粒体自噬介导的线粒体消除作用，清除受损的线粒体[15]。PINK1还能通过诱导自噬作用将α-syn降解[3]。然而，慢性线粒体应激或Parkin或PINK1基因突变引起的α-syn的长时间或者无节制激活会导致线粒体过度分裂、线粒体功能衰竭，最终导致神经细胞死亡和PD。α-syn、PINK1和Parkin三者共同作用于线粒体上，揭示了这些基因在线粒体的应激反应中的功能，在未来α-syn的特定功能进一步被研究，能对PINK1/Parkin和PD方面的研究进一步加深。

表1 PD相关基因的位置功能及发病年龄

表2 PD相关基因的变异类型

3 DJ-1基因突变通过影响溶酶体自噬导致α-syn降解异常

DJ-1基因定位于染色体1p36.23，含7个外显子，编码DJ-1蛋白，是含189个氨基酸的蛋白多肽链。早在2003年Bonifati等人，已经确认DJ-1(Park7)基因为早发性常染色体隐性遗传性PD。目前证实，DJ-1基因与PD相关的致病突变主要有9个(见表2)。DJ-1蛋白是一种20 kDa的具有多种功能的小蛋白，参与多种细胞过程，如抗氧化应激、伴侣功能、转录调节、蛋白酶活性和线粒体调节等[4]。由于其广泛的功能，目前很难阐明它是如何与α-syn相互作用，以及如何介导多巴胺能神经元变性导致PD。最近的研究证实， DJ-1与α-syn相互作用，影响病理性α-syn的聚集过程，部分氧化的DJ-1具有一个粘附表面，它隔离了α-syn单体，阻断了α-syn聚集的早期阶段，也限制了α-syn纤维的伸长。DJ-1将成熟的α-syn纤维改造成异构体的有毒寡聚体，使其能够更好的被清除，减轻其毒性作用[16]。此外，DJ-1缺乏通过加速溶酶体2A 型相关膜蛋白(LAMP2A)的降解，而溶酶体LAMP2A水平是伴侣介导的自噬(CMA)调节的主要靶点。当DJ-1缺乏时，CMA功能相应缺乏，导致α-syn的积累而发生PD[4]，这与先前Chenere等人的结论相反，他们在体内实验得到DJ-1没有直接调节α-syn的功能，也没有保护致病性α-syn的有害作用[17]。另外，Parkin、PINK1和DJ-1基因突变已被证明能够引起多巴胺和Ca2+稳态的破坏，导致多巴胺氧化醌的形成、线粒体功能障碍和相关的氧化应激[18]。这些条件触发了α-syn聚集，随后恶性循环使神经元死亡。

4 LRRK2基因突变导致多种结构异常影响α-syn降解

LRRK2基因位于染色体12q12，含51个外显子，全长144 kb。LRRK2基因突变与常染色体显性遗传和特发性PD相关。LRRK2编码一个大的(2527个氨基酸)多结构域蛋白(富含亮氨酸重复蛋白2，LRRK2)。LRRK2除了有激酶结构域(kinase)外，还具有第二个酶性GTPase结构域(ROC/COR结构域)[19]。近期研究LRRK2至少有8个致病的突变与PD相关，4个在GTPase/ROC结构域(N1437H和R1441C/G/H)，3个在激酶结构域(I2012T、G2019S和I2020T),一个在COR结构域(Y1669C)(见图1)。突变之间存在差异，因为激酶结构域的突变直接增加了激酶活性，而ROC-COR结构域的突变则降低了GTPase的活性。其中G2019S突变最频繁，其次是R1441C/G/H。G2019S LRRK2促进了黑质多巴胺能神经元的α-突触核病和变性已被广泛报道[20,21]。LRRK2参与了许多细胞功能和途径，包括囊泡运输、细胞骨架动力学、神经递质释放、突触可塑性、高尔基体和线粒体功能以及免疫反应[19]。除此之外，LRRK2在自噬中的作用也得到证实[22]。LRRK2的这一作用，可能是LRRK2位于GTPases效应结合基序中心的一个高度保守的位点上，通过磷酸化Rab蛋白的一个亚群导致其功能丧失，包括Rab8A、Rab10和Rab12。Rab蛋白是膜运输、协调囊泡形成、囊泡沿肌动蛋白和微管蛋白网络运动以及膜对接和融合的主要调节因子，这些都是自噬和溶酶体生物学中的重要方面[23]，也是清除α-syn的重要途径。另外，易受伤害的多巴胺神经元中的LRRK2激酶活性通过涉及α-syn和线粒体损伤的氧化应激机制异常增加，从而导致内溶酶体功能障碍和磷酸化α-syn的积累[24]。LRRK2突变通过以上几种可能的机制促进PD。

图1 LRRK2结构域与致病突变的线性模型

5 VPS35基因突变通过影响逆转录复合物作用导致α-syn聚集

VPS35基因位于染色体16q11.2 位点，含17个外显子，编码蛋白长29.6 kb空泡蛋白分选35(VPS35)。在2011年，Zimprich等人研究证实该基因突变与家族性PD有关，也是常见的散发性PD原因[25]。最近在3个奥地利家系的14 例具有PD患者的VPS35基因中发现了一个新的常染色体显性遗传性帕金森病突变(p.Asp620Asn)，也证实了p.Asp620Asn突变体是晚发性帕金森病的病因[26]。 VPS35与VPS29和VPS26a是逆转录复合物的组成部分，复合物的功能是与不同的分拣连接素相互作用，将货物从内体中分拣出来，并且能够协调将其中某些蛋白质运输到反式高尔基体，逆转录复合物发生异常已经确定为与PD过程有关[27]。在动物PD模型中，VPS35和α-syn之间建立了直接联系，在该模型中VPS35缺乏会导致a-syn积聚[28]。进一步的研究表明，VPS35缺陷的DA神经元或表达PD的D620N突变体的DA神经元受到损害，加速了LAMP2A的降解，导致CMA自噬障碍，使α-syn聚集[8]。VPS35 D620N突变体还能导致复合物Ⅰ和Ⅱ的酶活性降低和呼吸缺陷，其可能是D620N突变体导致患者成纤维细胞中的组装复合物Ⅰ和Ⅱ以及超复合物的水平显著降低，导致生物能量缺陷[29]。然而，不能排除是否为VPS35 D620N突变体通过影响α-syn聚集间接影响复合物Ⅰ的可能性。VPS35缺失或突变可能导致多个分子/细胞通路的缺陷，这些缺陷共同促进PD的发病。

6 总结与展望

综上所述，无论是SNCA基因本身突变导致的异常α-syn聚集，还是parkin/PINK1和DJ-1突变与线粒体作用异常，以及LRRK2和VPS35异常突变导致自噬障碍，都能导致PD的发生。虽然他们在不同的途径上作用，但都与一个中间物α-syn相联系。虽然目前对α-syn及PD发生的相关机制仍需要进一步研究，但是，随着今后人类对基因测序、基因识别等的进一步发展，将对上述基因与α-syn的相互作用有进一步的了解，为PD的诊治提供更多的依据。