碳源对膨胀污泥微生物多样性的影响研究

高春娣，张 娜，韩 徽，任 浩，侯春艳，李 悦，王传德

(北京工业大学环境与能源工程学院，城镇污水深度处理与资源化利用技术国家工程实验室，北京 100124)

就丝状菌污泥膨胀而言，尽管已有众多研究对与之相关的环境条件和处理工艺进行了全面的总结和改进[1-3]，但如一些污水本身的水质特点极易诱发膨胀. 季节变化导致的温度变化极易诱发膨胀等问题在实际运行中常常难以避免，从而加大了污泥膨胀的防治难度. 而在丝状菌膨胀的微生物学研究领域，虽然已发现并总结了许多优势丝状菌的生理生态学特性，但相关的纯培养仍存在较高的误差和失败率[4]，使得已有的研究不够全面和深入. 必须认识到的是，活性污泥本质上是无数微生物群落所形成的复杂结合体，丝状膨胀正是微生物群落失衡而引发的典型问题[5]，故面对污泥膨胀微生物学研究的瓶颈，应当将过去围绕单一优势丝状菌的研究视角转移到针对微生物整体多样性的变化分析中. 近年来，随着先进分子生物学技术的发展和应用，高通量测序已在污水处理领域的诸多方面中取得了理想的应用效果[6-8]，也为膨胀领域相关问题的解决带来了新的可能. 针对目前膨胀相关测序虽已陆续开展[9-11]，但研究基础仍旧不足，理论基础仍旧不丰富不全面的研究现状，本实验以导致膨胀的水质特征为切入点，选取不同碳源进行了污泥膨胀的诱发实验，并借助高通量测序对膨胀污泥微生物多样性进行了较为全面的研究和对比分析，放大了以往的研究视角，丰富了本领域的研究内容，以期为该问题的应对和解决提供更多的理论支撑.

1 材料与方法

1.1 实验装置

本实验以SBR反应器(见图1)作为主要装置，2个反应器的容积均为8 L，运行期间每周期进水4 L、排水4 L，排水比50%. 反应器下部配备的曝气盘与转子流量计和空气压缩机连接，为活性污泥提供溶解氧，配备的WTW3420型溶氧仪装有DO、pH探头，不仅可用于观察反应器内实际溶解氧水平，还可实现系统内pH的实时监测，装置上部电动搅拌器的主要功能是保证泥水充分混匀. 此外，还根据实际需求设置了进水口与排水口，分别与蠕动泵和电动阀相连，实现系统的自动进排水.

1—电动搅拌器；2—加热棒；3—pH探头；4—DO探头；5—WTW3420型溶解氧仪；6—电动机；7—取样口；8—气体流量计；9—曝气盘；10—空气压缩机；11—蠕动泵；12—配水水箱. 图1 SBR反应器示意图Fig.1 Scliematic diagram of SBR reactor

1.2 实验水质和污泥

本实验接种污泥为北京市高碑店污水处理厂二沉池回流污泥，具有较好的污泥沉降性能和脱氮除磷性能. 进水采用人工配水，2个反应器分别以淀粉和乙酸钠为主要碳源，详细配水水质参数如表1、2所示. 配水水质中的微量元素为1 mL/L.

表1 人工配水水质情况

表2 微量元素配方

1.3 实验运行方案

本实验采取传统硝化反硝化工艺，分3个阶段共运行80 d，阶段一和阶段二每天运行3周期，为污泥驯化及膨胀发生阶段，该阶段主要目的是使污泥适应本实验所采取的的水质及运行方式后尽早进入膨胀阶段，该期间控制溶解氧在2 mg/L以上运行. 阶段三每天运行2周期，为恶性污泥膨胀阶段，由于该阶段污泥沉降性能较差，故延长了污泥沉淀时间，具体的运行案如表3所示.

表3 实验运行方案

1.4 分析指标和方法

在本实验的分析过程中，SVI、MLSS、TN等根据标准方法测得[12]，COD采用连华科技5B-3 COD快速测定仪测定. 在对污泥絮体进行革兰染色染色后，根据Olympus BX61型显微镜的镜检结果及Eikelboom丝状菌手册进行优势丝状菌的判定，并结合高通量测序的结果，进行微生物群落多样性的分析.

2 结果与讨论

2.1 丝状菌污泥膨胀的发生

2.1.1 丝状菌污泥膨胀过程中的沉降性变化

全阶段运行期间的污泥沉降性能如图2所示，可以看出，虽然2个反应器的运行方式相同，但在不同碳源下的沉降性能却存在差异，以淀粉为碳源的SBR1在运行至第34天左右就出现了SVI值的升高，但该现象仅持续了10 d左右，之后沉降性能又逐渐变好. 继续运行至第53天左右时SVI迅速升高至300 mL/g左右并持续恶化至第64天时的479 mL/g，之后再次呈现沉降性能的转好，这说明淀粉进水下的污泥膨胀具有一定波动性，但沉降性能仍能恶化至较为严重的状态. 尽管Wang等[13]的研究认为改用红薯淀粉为碳源可抑制以葡萄糖为碳源于完全混合工艺下导致的丝状菌污泥膨胀，改善污泥沉降性能，在采用可溶性淀粉为碳源的本实验中，仍发生了丝状菌膨胀，这可能是由于本实验对使用的可溶性淀粉进行了加热以便于淀粉在配水中的溶解. 而Wang等则通过将淀粉废水保存在4 ℃环境下来避免其水解，由于较多未水解的颗粒态淀粉有利于菌胶团菌的附着，会增大污泥絮体的粒径和质量，改善污泥沉降性能，且加热后的淀粉会水解出葡萄糖等低分子化合物，有助于丝状菌等微生物的吸收利用，从而使得本实验中发生了污泥膨胀，出现了沉降性能的波动. 此外，在Guo等[14]以可溶性淀粉为碳源的实验中也发生了丝状菌污泥膨胀，但本实验中SVI最严重时可恶化至479 mL/g，而Guo等实验中的SVI最高却不超过400 mL/g，可见本实验中的污泥沉降性能更差一些. 产生这种现象的原因可能是本实验中采取的传统硝化反硝化运行模式与Guo实验中阶段一先缺氧后好氧，阶段二和阶段三又全程好氧的运行模式有所不同. 由于先缺氧后好氧的运行模式起到了缺氧选择器的作用，可以在阶段一期间洗脱掉一部分好氧丝状菌，且后续阶段二、三的全程好氧又提供了足够的溶解氧，因此对菌胶团菌产生的抑制作用更小，从而使得系统中丝状菌的丰度更小，沉降性能更好. 相较于SBR1中污泥沉降性能呈显示出的波动性，以乙酸钠为进水碳源的SBR2中的SVI值则变化得较为规律，随运行时间变化呈逐步升高趋势，中间没有发生沉降性能的自我恢复，在系统运行至第26天时，反应器内活性污泥的SVI值便先于SBR1开始升高，并持续恶化至527 mL/g，这与其他乙酸钠进水下污泥膨胀的相关研究结果较为一致.

图2 全阶段运行期间的污泥沉降性能变化Fig.2 Variation of SVI during the full-stage operation

2.1.2 丝状菌污泥膨胀过程中的污染物去除效果

如图3所示，2种碳源进水下虽然都发生了污泥膨胀，但是反应器运行期间全阶段污染物去除效果仍维持在较好水平，2个反应器的COD去除率均可维持在90%以上，TN去除率均可维持在80%以上. 这说明丝状菌污泥膨胀的发生不一定伴随着污染物处理效果的下降，即便在恶性污泥膨胀期间，活性污泥仍能保持较好的处理效果. 观察图3可以发现，全阶段运行期间出水水质较差的时间点主要集中在反应器运行的前3周左右，而该阶段正是实验过程中的污泥驯化阶段，从污水厂取来的活性污泥投加到本实验中的人工配水环境中，需要适应一段时间，故在实验初期出现了一定的水质波动. 而随着反应器的不断运行，污泥逐渐适应了本实验的运行条件与进水水质，加之后期污泥膨胀的成功诱发使得丝状菌不断增殖，它们的菌丝或从絮体内部伸出，或缠绕包裹于絮体表面，从而会产生网捕作用[15]，促进水质的净化，提升污染物的去除效果. 此外，本实验中也发现了诸多在污泥膨胀后相对丰度仍呈上升趋势的脱氮菌与菌胶团菌，这些功能菌的增殖说明活性污泥仍可维持正常的脱氮功能，且本实验中在2种碳源下广泛分布的优势丝状菌Thiothrix也具有一定的有机物降解能力与脱氮功能[16]，其在污水中的大量增殖进一步强化了污水的处理效果. 故上述因素不仅为本实验中较好的污染物处理效果带来了解释，也说明本实验中的2种碳源类型虽会使污泥产生不同的沉降性能变化，却不会对污染物的整体处理效果产生较大影响.

图3 全阶段运行期间的污染物去除效果Fig.3 Pollutant removal efficiency during the continuous operational period

2.2 微生物菌群多样性的整体变化

2.2.1 膨胀污泥微生物菌群的Alpha多样性分析

为探究丝状菌膨胀污泥的微生物多样性变化，对膨胀前后的活性污泥进行了高通量测序，并对高通量测序获得的序列进行了Alpha分析，结果如表4所示.

表4 不同污泥样品的Alpha多样性分析

由表4所示，SBR1.1与SBR1.2分别对应淀粉碳源进水下的原始泥样和膨胀泥样，SBR2.1和SBR2.2分别对应乙酸钠碳源进水下的原始泥样和膨胀泥样. 在本次测序的4个污泥样品中分别获得了51 373、67 592、63 410和71 937条优化序列，为便于不同样本间微生物多样性的对比分析，以最少序列数51 373进行数据抽平，并在97%的相似水平下进行Alpha多样性分析后，在4个不同的污泥样本中分别得到964、713、951和903个OTUs，即2个反应器内的OTUs数均因污泥膨胀的发生而降低，其中淀粉废水降低数量为251，是乙酸钠废水降低数量48的5倍多，说明相较于乙酸钠，淀粉对菌群结构有更大的影响. 此外，常用于代表微生物菌群丰度的Ace指数、Chao指数、Sobs指数和常用于估算污泥中微生物的多样性和均一性的Shannon指数分别由SBR1.1中的348、343、323、4.261和SBR2.1中的381、382、338、3.946降低至SBR1.2中的334、341、303、3.891和SBR2.2中的340、344、307、3.882. 且常用于衡量样品中微生物的丰富度的Simpson指数也由SBR1.1中的0.027以及SBR2.1中的0.043升高至SBR1.2中的0.046以及SBR2.2中的0.056. 故由这些指数的变化可知，随污泥膨胀的发生及沉降性能的恶化，系统内微生物的数量、丰度、均一性、多样性及丰富度均呈降低趋势，污泥膨胀对微生物多样性产生了较大影响.

2.2.2 膨胀污泥微生物菌群整体变化特征

如图4所示，在来自2个反应器的4个泥样中共检测出10种门类微生物，在4个样本中占比最大的门类均为Proteobacteria，其在不同碳源引发的污泥膨胀中展现出了不同的变化趋势：在以淀粉为进水碳源的SBR1中，其相对丰度由未膨胀时的50.62%升高至膨胀后的62.89%，而在以乙酸钠为进水碳源的SBR2中，相对丰度由未膨胀时的64.34%降低至膨胀后的62.86%，Actinobacteria与其变化规律相同，Bacteroidetes和Elusimicrobia的相对丰度则与它们相反，在SBR1中降低，在SBR2中升高. 说明以淀粉为碳源的废水环境更利于Proteobacteria与Actinobacteria两种门类微生物的生长，Bacteroidetes和Elusimicrobia则更适合在以乙酸钠为碳源的废水中生长. 此外，在本次检测出的菌群中，Chloroflexi、Planctomycetes、Patescibacteria、Nitrospirae和Acidobacteria的相对丰度在2个反应器内均呈降低趋势，Verrucomicrobia的相对丰度在2个反应器内均上升. 这说明在本实验的运行条件下，2种碳源对以上6种门类微生物产生的影响是相同的.

图4 膨胀污泥微生物菌群的整体变化Fig.4 Overall changes of relative abundance in bulking sludge

为了更好地区分膨胀污泥中不同种类微生物的多样性变化，将高通量测序在属水平检测出的微生物按照其在污水处理过程中所执行的功能分成了五大类，第1类是在污泥絮体中担任菌胶团骨架结构的丝状菌，通常也是造成污泥膨胀的主导菌；第2类及第3类是在污染物去除过程中起主要作用的脱氮菌和除磷菌；第4类是本次检测出的其他菌胶团菌；第5类则是属水平上检测出占比却无法确定菌属名称及相应功能的其他微生物. 从图4中可以看出，污泥膨胀的发生使这5类微生物菌群的相对丰度都发生了变化，或同时升高或同时降低，而尽管不同碳源下各功能菌群的丰度变化较为一致，不同反应器中除磷菌的占比差异却很大，在以乙酸钠为进水碳源的SBR2中的占比远高于以淀粉为进水碳源的SBR1. 这说明就不同功能菌群在膨胀前后的整体丰度变化而言，2种碳源所产生的影响大致相同，但就除磷菌群在所有微生物中的整体占比而言，乙酸钠为碳源比淀粉为碳源更利于除磷菌的增殖.

2.3 膨胀污泥各特定菌群及特定菌属的变化特征

2.3.1 丝状菌群的相对丰度变化

如图5所示，革兰氏染色及镜检结果表明2种不同碳源下的优势丝状菌存在差异，在以淀粉为碳源的SBR1中可以明显观察到2种优势丝状菌，一种丝状菌呈革兰氏阴性，菌丝较粗且内有硫粒积累，推断为Thiothrix[17]，而另一种丝状菌也为革兰氏阴性菌，但菌丝又细又长，推断为Haliscomenobacterhydrossis[18]. 而在乙酸钠为进水碳源的SBR2虽同样发现了大量Thiothrix，却没有观察到H.hydrossis.

图5 革兰氏染色和丝状菌相对丰度变化图Fig.5 Gram stain and relative abundance of filamentous bacteria

高通量测序的结果与革兰氏染色的结果较为一致，在2个反应器的泥样中均检测出了大量的Thiothrix菌，其在SBR1和SBR2的膨胀泥样中相对丰度分别占到7.11%和9.56%，在以乙酸钠为碳源的SBR2中的相对丰度稍高，但整体差异不大. 属水平上的第二优势菌为Haliscomenobacter，其分类下的H.hydrossis正是前述镜检染色中发现的丝状菌，该菌在2个不同反应器中的相对丰度与镜检染色的结果也较为一致，在SBR1膨胀污泥中的相对丰度为2.39%，是SBR2膨胀污泥中0.56%的4.3倍左右，远高于SBR2. 而在剩余的4种丝状菌属中，除来自Actinobacteria门的Tetrasphaera的相对丰度在2个反应器中均呈降低趋势外，另外3种菌属Tessaracoccus、Nocardioides和Mycobacterium的相对丰度在不同反应器中呈现出了相反的变化趋势. 即2种碳源对这3种菌属的增殖产生了不同的影响，Tessaracoccus和Mycobacterium更适宜在以淀粉为碳源的废水中增殖，乙酸钠为碳源的废水会造成二者丰度的降低，而Nocardioides则更适宜在以乙酸钠为碳源的废水中增殖，淀粉为碳源的废水会造成其丰度的降低.

2.3.2 脱氮菌的相对丰度变化

图6 脱氮菌相对丰度变化图Fig.6 Relative abundance of denitrification bacteria

2.3.3 除磷菌的相对丰度变化

如图7所示，本实验在属水平中共检测出8种与生物除磷有关的菌属，分别为3种聚磷菌属和5种聚糖菌属，其中共5种菌属的相对丰度在不同碳源废水下呈现出了相同的变化，说明2种碳源对其增殖变化的影响相同，而作为聚磷菌的Pseudomonas、Acinetobacter和作为聚糖菌的Amaricoccus的相对丰度则在不同碳源废水下呈现了不同的变化.C.Accumulibacter是一种典型的聚磷菌，有报道称在乙酸作为单一碳源时，可得到大量的该菌[22]，在本实验中，其在乙酸钠为进水碳源的SBR2中的确有相较淀粉为进水碳源的SBR1中更大的系统占比.C.Competibacter为EBPR系统中一类经常出现的聚糖菌，也是本分类下相对丰度最大的菌属，其在2个反应器中的相对丰度均随污泥膨胀的发生呈降低趋势，同样作为聚糖菌的Tetrasphaera、Micropruina及Defluviicoccus的丰度变化与之相同.Tetrasphaera除作为EBPR系统中最丰富的除磷菌外，还具有一定的脱氮能力[23].Micropruina是一种能够积累细胞聚磷酸盐,且在好氧条件和厌氧条件下均可以利用和贮存各种糖类为聚合糖的菌属，对除磷和CODCr有很大贡献[24]. 有报道称Defluviicoccus在以乙酸盐为碳源的好氧颗粒污泥中为主要微生物，在本实验中，其在淀粉为进水碳源的SBR1中也大量分布[25]. 由于Pseudomonas属下包含多种反硝化聚磷菌[26]，因此在污染物去除过程中既可以执行脱氮功能，也可以执行除磷功能.Acinetobacter是一种可以在很宽的温度范围内生长的菌属，在自然界中分布较为广泛[27].Amaricoccus是本次实验中占比最小的除磷菌，其在原始泥样中的占比仅为0.01%，有关Amaricoccus的研究报道较少.

图7 除磷菌相对丰度变化图Fig.7 Relative abundance of dephosphorization bacteria

2.3.4 其他菌胶团菌的相对丰度变化

为便于分析，对属水平上发现的其他菌胶团菌中相对丰度占比在前20的菌属进行绘图，结果如图8所示. 可以发现，在选取的其他菌胶团菌中共有Reyranella等8种(40%)菌属的相对丰度在2种碳源下均随膨胀的发生而降低；Zoogloea等7种(35%)菌属的相对丰度在2种碳源下均随膨胀的发生而升高；Stella等5种(25%)菌属的相对丰度在2种不同碳源下变化趋势不同. 而在所有来自其他菌胶团菌的20种微生物中，占比最大的为来自β-Proteobacteria的好氧菌Zoogloea，作为活性污泥菌胶团絮体形成的代表性微生物，Zoogloea不仅能够有效去除污水中的有机物质，降低污水的BOD和COD，且在污水处理厂的脱氮除磷过程中也发挥着重要作用[28-29]，从而在许多污水处理厂活性污泥中都占有优势地位[30]. 在本实验中，该菌膨胀前后的相对丰度为7%～19%，且在2个反应器中的相对丰度均随膨胀的发生呈上升趋势，从而在一定程度上促进了出水水质的提升. 在6种相对丰度受碳源选择性影响的菌属中，Haliangiums是粘细菌的一种，Bryobacter则能够促进土壤的碳循环，两者均多见于土壤及海洋细菌群落的相关研究[31]，有关Stella、Inhella和Opitutus的报道则相对较少，对应的生理特性信息较少，有待进一步的研究.

图8 其他菌胶团菌相对丰度变化图Fig.8 Relative abundance of other floc-forming bacteria

3 结论

1) 相较于乙酸钠进水下沉降性能的持续恶化，淀粉进水下的沉降性能具有一定波动性. 虽然2种不同的进水碳源均能引起污泥沉降性能的恶化，但对污染物的去除效果没有较大影响，2个反应器在实验期间均保持了较好的出水水质.

2) 2个反应器内微生物整体的丰度、均一性、多样性及丰富度均因污泥膨胀的发生而有所降低，淀粉进水下发生的污泥膨胀使反应器内OTUs数减少了251，是乙酸钠进水下减少数量的5倍多，表明其对微生物多样性的影响大于乙酸钠.

3) 所有泥样中相对丰度最大的门类均为Proteobacteria，其相对丰度在SBR1中降低，在SBR2中升高，说明以淀粉为碳源的废水环境更利于该门类微生物的生长. 淀粉进水中第一优势丝状菌Thiothrix的相对丰度与乙酸钠进水差别不大，但第二优势菌Haliscomenobacter的相对丰度远高于乙酸钠进水.

4) 在不同菌群中，2种碳源对除磷菌群的丰度影响较大. 而在不同菌属中，作为优势丝状菌的Thiothrix和Haliscomenobacter的相对丰度在2种碳源下均随污泥膨胀的发生而增高；作为典型脱氮菌的Nitrospira以及典型除磷菌的C.Accumulibacter和C.Competibacter的相对丰度均随污泥膨胀的发生而降低；同样作为典型脱氮菌的Nitrosomonas以及典型菌胶团菌的Zoogloea的相对丰度则随污泥膨胀的发生而升高.