竹节参水提物对宫颈癌Hela 细胞凋亡的影响

刘 滢，黄 宙

（1.湘潭医卫职业技术学院，湖南湘潭 411102；2.湘潭市中心医院，湖南湘潭 411100）

竹节参为五加科植物，性温、味甘、味苦，具有滋补强壮、散瘀止痛及止血祛痰功效［1-4］，广泛用于产后虚弱、咳嗽痰多及跌打损伤患者中［5］。现代药理结果表明［6］，竹节参具有抗炎、延缓衰老、降血糖及抗肿瘤作用。皂苷是竹节参的主要活性成分（约占23.6%），且三萜类皂苷具有较高含量，具有解热、抗菌、抗癌等生物作用。国内学者研究表明［7］，天然药物具有较低的毒副作用，临床使用时不宜产生耐药性，且对实体瘤具有良好的疗效，但是在宫颈癌中的作用机制研究相对较少。因此，本研究以宫颈癌Hela 细胞作为对象，探讨竹节参水提物在宫颈癌Hela细胞中的作用机制及对细胞凋亡的影响，以期为宫颈癌治疗提供新思路。

1 材料

1.1 细胞 宫颈癌Hela 细胞购于中国科学院细胞库，将其接种在含10% 胎牛血清的RMPI-1640 培养基中，在含5%CO2的37 ℃培养箱中培养，待细胞融合80%后进行传代培养，取第3 代对数生长者，备用。

1.2 药材 竹节参产地湖北恩施，购于恩施竹节参种植基地，经专家鉴定为正品。将药材根茎干燥粉碎后纯净水回流提取3 次，滤液浓缩，即得提取物，提取率为25.8%，加入 DMEM 培养基依次制成 0（阴性对照）、50、100、150 μg／mL。

1.3 仪器 见表1。

表1 仪器信息

2 方法

2.1 细胞处理 取第3 代培养的宫颈癌Hela 细胞，0.25%EDTA 进行消化，调整细胞浓度为1×105／mL，接种在96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培养箱中至单层细胞。将0（阴性对照）、50、100、150 μg／mL 竹节参提取物分别加入宫颈癌Hela 细胞中（100 μL／孔），每种质量浓度设置5 个复孔，将培养板放置在37 ℃、5%CO2培养箱中，连续进行48 h 培养［8］。

2.2 细胞凋亡测定 采用一步法TUNEL 染色测定。取各组处理后的细胞，加入0.25% EDTA-胰蛋白酶完成细胞消化，调整细胞密度为2×105／mL，接种在96 孔板中，每孔200 μL，放入培养箱中48 h。在12、24、36、48 h 后向细胞中滴加TUNEL 检测液（含TdT 酶2 μL、荧光标记液48 μL），避光孵育，荧光显微镜下观察细胞情况，并且在波长480 nm、发射光540 nm 处测定OD值，每张图片取5 个视野，在400 倍下完成凋亡细胞核计数，获得凋亡率［9］。

2.3 细胞周期测定 采用流式细胞计数仪测定。取生长良好的宫颈癌Hela 细胞，调整细胞浓度为1×105／mL，接种在6 孔培养板中，连续培养24 h 后换入新鲜培养基，连续培养48 h 后加入不含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶消化悬浮，4 ℃下收集细胞。采用预冷的PBS 缓冲液（pH 值为7.4）对细胞冲洗2 次，加入-20 ℃预冷的乙醇3 mL，吹打均匀后放置在-20 ℃冰箱中固定24 h。测定前对各组细胞离心10 min（1 424×g），PBS 缓冲液冲洗2次，去除上层清液后重悬于200 μL 0.1 mmol／L EDTA 溶液中，30 min 避光孵育后加入35 μL 2% Tritonx-100、114 μL 150 μg／mL PI 溶液，充分混合后避光反应10 min，将最终获得的混合液于EPICS XL 型流式细胞仪中完成细胞周期测定［10］。

2.4 细胞形态观察 采用Hoechst 33342 荧光染色观察。取不同质量浓度竹节参水提物处理后的细胞，离心10 min后去除上层清液，加入10 g／L Hoechst 33342 荧光染色液，避光染色10 min 后去除染液，PBS 洗涤2 次后涂片，晾干后在荧光显微镜下观察，波长为340 nm，保存结果［11］。

2.5 凋亡相关基因测定

2.5.1 RNA 提取 向各组处理后的细胞中加入500 μL trizol，混合、均匀后加入氯仿0.2 mL，剧烈振荡15 s，常温下静置2～3 min 后离心15 min（12 000 r／min），获得3层液体（上层为水相，中间层与下层为有机相）。取RNA沉淀，转移到新的EP 管中，加入0.5 mL 异丙醇，混合后放在-20 ℃冰箱中，10 min 离心（1 194×g），获得凝胶状沉淀（即为RNA）。充分洗涤RNA，加入250 μL DEPC、750 μL 乙醇，乙醇冲洗沉淀，离心5 min（2 315×g），取沉淀放入工作台上干燥20 min。利用紫外分光度仪检测RNA 浓度，并完成RNA 提纯（以核糖核酸酶作为空白对照），在260 nm 波长处测定吸光度。采用脱氧核糖核酸酶处理RNA 后，放入冰箱中［12］。

2.5.2 PCR 检测 采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）法测定P53、Bax、Casepase-3 mRNA 表达水平，引物序列见表2。设定PCR 反应条件为30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min，连续进行35个循环，最后在72 ℃下完成10 min 延长。扩增产物放入1.5%琼脂凝胶中电泳，完毕后采用UVP 凝胶图像完成灰度值的测定，以β-actin为内参［13］。

表2 引物序列

2.6 统计学分析 通过SPSS18.0 软件进行处理，计数资料以百分率表示，组间比较采用卡方检验；计量资料以（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 竹节参水提取物对宫颈癌Hela 细胞增殖的抑制作用 竹节参水提取物对宫颈癌Hela 细胞增殖具有明显的抑制作用，并呈浓度、时间依赖性，36 h 后可达50.0%以上，见表3。

3.2 竹节参水提取物对宫颈癌HeLa 细胞周期的影响 竹节参水提取物主要作用于宫颈癌Hela 细胞G0／G1期与S期，随着其剂量升高逐渐集中于G0／G1期，见表4。

3.3 竹节参水提取物对宫颈癌HeLa 细胞形态的影响 Hoechst 33342 荧光染色显示，0 μg／mL 竹节参水提物下Hela细胞形态均一，结构相对完整；在50、100、150 μg／mL下，Hela 细胞开始出现凋亡，细胞形态固缩，可见凋亡小体，并且剂量越高，细胞凋亡越明显，见图1。

表3 竹节参水提取物对宫颈癌Hela 细胞增殖的抑制作用（%，， n＝4）

表3 竹节参水提取物对宫颈癌Hela 细胞增殖的抑制作用（%，， n＝4）

注：与0 μg／mL 比较，∗P＜0. 05；与12 h 比较，#P＜0.05。

表4 竹节参水提取物对宫颈癌Hela 细胞周期的影响（%，， n＝4）

表4 竹节参水提取物对宫颈癌Hela 细胞周期的影响（%，， n＝4）

注：与0 μg／mL 比较，∗P＜0.05。

图1 不同剂量竹节参水提取物下宫颈癌Hela 细胞形态

3.4 竹节参水提取物对宫颈癌HeLa 细胞凋亡基因表达的影响 竹节参水提取物可增加宫颈癌Hela 细胞中P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表达，并呈浓度依赖性，见表5、图2。

表5 竹节参水提取物对宫颈癌Hela 细胞凋亡基因表达的影响（， n＝4）

表5 竹节参水提取物对宫颈癌Hela 细胞凋亡基因表达的影响（， n＝4）

注：与0 μg／mL 比较，∗P＜0.05。

4 讨论

图2 不同剂量竹节参水提取物下宫颈癌HeLa细胞凋亡基因表达

宫颈癌是女性发生率较高的恶性肿瘤，具有发病率高、治愈率低、致死率高等特点［14］。目前，化疗、手术与放疗占据宫颈癌治疗的主要地位，但是无论何种方法均存在明显的局限性，且治疗均无法做到彻底、副作用较大，患者治疗后复发率较高，导致患者远期生存率较低［15］。竹节参是临床上常用的中药，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰等作用［16］。体外及动物实验结果表明［17］，竹节参水提物对于肝癌、鼻咽癌、肺癌及胃癌等实体瘤具有良好的抗肿瘤作用，能抑制肿瘤细胞的增殖与生长，诱导肿瘤细胞凋亡。同时，竹节参水提物能抑制血管的形成，有助于增强机体免疫功能。有研究表明［18］：竹节参具有抗炎及潜在的抗肿瘤作用，其水提物能显著增强机体免疫水平，能抑制肿瘤细胞的生长。因此，本研究基于当前研究，分析了竹节参水提物对于宫颈癌HeLa 细胞的作用机制，结果表明：竹节参水提取物对宫颈癌Hela 细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性，能促进细胞凋亡，且细胞的凋亡率随着竹节参水提取物浓度、作用时间的延长增加，36 h时竹节参水提取物对宫颈癌Hela 细胞增殖抑制基本达到50.0%以上；竹节参水提取物作用于宫颈癌Hela 细胞G0／G1期与S 期；随着竹节参水提取物浓度升高，竹节参水提取物对于宫颈癌Hela 细胞作用集中于G0／G1期，说明竹节参水提物能抑制宫颈癌HeLa 细胞的增殖、生长，能促进细胞凋亡，药物多作用于细胞生长初期，且药物浓度越高，作用效果越明显。

细胞凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、有序的死亡。细胞凋亡有别于细胞坏死，其过程不是被动的过程，而是主动的过程，多涉及基因的激活、表达与调控作用，是为了更好的适应生存而主动争取的一种死亡过程［19］。但是，对于肿瘤细胞而言其生长无限增殖，导致细胞凋亡紊乱，会对宿主产生明显的不适，严重者可危及生命。P53 基因属于人体抑癌基因，含有大量的脯氨酸，其失活对肿瘤的形成具有重要的意义。临床研究表明［20］，P53 基因是相对重要的抗癌基因，其野生型能诱导细胞凋亡，防止癌变的发生，亦可辅助细胞基因修复。但是，P53基因发生突变后，则会增加癌变发生率。Bax 基因属于兔抗人单克隆抗体，属于Bcl-2 基因家族中细胞凋亡的促进基因，其过度表达能拮抗Bcl-2 的保护效应，能使得细胞趋于死亡。研究表明：Bax 基因是人体主要凋亡基因，可与Bcl-2 形成异二聚体，能抑制Bcl-2 的产生，是人体相对重要的促细胞凋亡基因之一。Caspase-3 在细胞凋亡中具有不可替代的作用，可以被多种因素活化，在CTL 细胞杀死中发挥重要作用。临床研究表明：Caspase-3 与DNA 修复、基因完整性监护等有关。本研究中，Hoechst 33342 荧光染色结果表明：竹节参水提物0 μg／mL 时HeLa 细胞形态均一且结构相对完整；而竹节参水提取物 50、100、150 μg／mL下HeLa 细胞开始出现凋亡，细胞形态固缩，可见凋亡小体；竹节参水提取物能增加宫颈癌HeLa 细胞中凋亡相关基因P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表达，且竹节参水提取物浓度越高，凋亡相关基因P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表达越高，说明竹节参水提物能诱导细胞凋亡，能增加凋亡基因表达水平，进一步促进肿瘤细胞凋亡。

综上所述，竹节参水提物体外能抑制宫颈癌HeLa 细胞增殖，能诱导癌细胞的自噬与凋亡，可能与调控凋亡相关基因mRNA 表达有关，具有潜在的抗癌作用。