液相色谱-串联质谱法测定猪尿液中地西泮及其7 种代谢物残留

张祖维，李木子，李雪莲，张鸿伟，曹旭敏，孙晓亮，隋金钰，宋翠平，霍乃蕊，赵思俊

（1.山西农业大学动物医学学院，山西晋中 030801；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266113；4.青岛海关技术中心，山东青岛 266002）

地西泮（Diazepam）又名安定，是苯二氮卓类药物的典型代表，具有镇静催眠、抗惊厥的作用，是兽医临床上用来减轻或消除动物狂躁不安，使动物恢复平静的药物[1]。然而，该类药物常被不法分子作为饲料添加剂用于畜禽养殖过程，对畜禽起到镇静催眠、增重催肥、缩短出栏时间的作用，从而达到非法牟利目的。另外，我国幅员辽阔，不同地区生猪、猪肉价格差异加大，因此出栏生猪长距离调运、异地屠宰的现象较为普遍。长途运输极易导致动物脱水、体重减轻，甚至死亡。为了减少损失，地西泮等镇静药物易被非法使用，而多数动物进入屠宰场后直接被屠宰，动物产品中残留的大剂量药物将对人类造成严重危害[2-3]，尤其是对患有心血管疾病的消费者。为此，我国、国际食品法典委员会（CAC）、欧盟（EU）等均规定在动物性食品中不得检出地西泮及其盐和酯[4-6]。

地西泮在生物体内通常被代谢酶生物转化为去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮、甲硝西泮、硝西泮、7-氨基甲硝西泮、7-氨基硝西泮等[1，7-10]，而且这些代谢物大多也具有生物活性，例如替马西泮、奥沙西泮、甲硝西泮、硝西泮等已被开发成药物并在临床应用[1]。因此，建立一种可同时测定猪组织中地西泮及其代谢物的检测方法显得尤为迫切。

目前，检测苯二氮卓类药物残留的方法有液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[3，9]、液相色谱-飞行时间质谱法[2，8]、气相色谱质谱法[11-12]、液相色谱法[7，10]以及免疫测定法[13]等。然而，针对地西泮及其代谢物的检测方法报道较少，且此类报道[7-9，12]主要针对人或小鼠尿液、血液中地西泮代谢物的测定，而对食品动物中地西泮及其代谢物的检测尚未见报道。由于在生猪贩运、屠宰环节，猪尿液的采集不仅方便、快捷，而且可活体采样，能有效避免对动物机体造成损伤，因此猪尿液常被作为屠宰前大批量采集、快速检测的对象[14]。本研究拟建立一种可同时测定猪尿液中地西泮及其7 种代谢物残留的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，以期为监控生猪贩运、屠宰环节违法使用苯二氮卓类镇静药物提供可靠的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AcquityTMUPLC-Xevo TQ MS 超高效液相色谱-串联质谱仪、UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、固相萃取装置，均为美国Waters 公司生产；阳离子固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL），购自美国Aglient 公司；高速冷冻离心机，购自德国Eppendorf 公司；氮吹仪，购自美国Organomation公司。

甲醇、乙腈（均为色谱纯），购自美国Merck公司；氨水（分析纯），购自中国国药试剂有限公司；甲酸（色谱纯），购自CNW 公司。

标准品：地西泮（Diazapam，1 mg/mL）、硝西泮（Nitrazepam，1 mg/mL）、7-氨基硝西泮（7-Aminonitrazepam，100 μg/mL）、甲硝西泮（Nimetazepam，1 mg/mL）、7-氨基甲硝西泮（7-Aminonimetazepam，100 μg/mL）、去甲西泮（Nordiazepam，1 mg/mL）、奥沙西泮（Oxazepam，1 mg/mL）等，购自美国Cerilliant 公司；替马西泮（Temazepam，1 mg/mL），购自美国O2Si 公司。8 种化合物的化学结构及转化图如图1 所示。

图1 地西泮及其代谢物的化学结构及转化图

1.2 标准溶液配制

分别取适量的标准物质，用甲醇配制成1 000 μg/L的标准物质储备液，-20 ℃保存；然后分别量取适量的8 种药物储备液于容量瓶中混合，配制10 µg/L混合标准工作液，-20 ℃保存备用。

1.3 样品前处理

准确量取猪尿液2 mL，加0.1%甲酸溶液1 mL，加入经3 mL 甲醇、3 mL 水活化的PCX 柱后，依次用3 mL 水和3 mL 60%甲醇水溶液洗涤，真空抽干，以3 mL 5%氨化甲醇溶液洗脱，50 ℃水浴条件下用N2吹干，最后用1 mL 初始比例流动相（0.1%甲酸水溶液:乙腈=8:2，V/V）复溶，以待检测。

1.4 色谱-质谱条件

1.4.1 色谱条件 流动相A 为0.1%甲酸水溶液，B 为乙腈，液相洗脱梯度条件见表1。进样量5 μL，柱温35 ℃，流速0.3 mL/min，流动相为0.1%甲酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脱程序为：0～0.5 min，80%～65%A；0.5～3.0 min，65%A；3.0～3.5 min，65%～55%A；3.5～4.0 min，55%A；4.0～4.5 min，55%～20%A；4.5～5.5 min，20%A；5.6～7.0 min，80%A。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，使用多反应监测（MRM）模式。毛细管电压2 800 V，离子源温度150 ℃，雾化室温度450 ℃；去溶剂气（氮气）流量1 000 L/h，锥孔气（氮气）流量50 L/h，碰撞气（氩气）流量0.24 L/h。各化合物定性、定量离子对及碰撞电压、毛细管电压等质谱检测参数见表1。

表1 8 种药物的保留时间、母离子、子离子及质谱检测参数

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件确定

选择一定浓度的标准溶液，利用Intellistart 软件，以ESI 正离子模式（ESI+）对待测药物进行母离子确认及子离子扫描。地西泮等药物分子结构中含有氮原子，且多呈仲胺或叔胺形式，在ESI 离子化方式下，极易形成[M+H]+。因此，选取[M+H]+作为药物的母离子，以正离子检测模式电离，分别对仪器的锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，进行子离子扫描。选取2 个丰度强、稳定的碎片离子作为定性与定量离子，以满足欧盟2002/657/EC[17]对禁用药物LC-MS/MS 方法定性监测的规定，即满足1 个母离子、2 个子离子共4 个鉴定点数的要求。8 种药物的保留时间及定性、定量离子及质谱检测参数见表1。

依据对CSH C18、BEH C18等不同键合相的色谱柱对药物分离进行比较的结果，本研究选用UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作为分析色谱柱。由于7-氨基硝西泮和7-氨基甲硝西泮2 种药物的极性较其他药物较强，因此本研究选用较低比例的有机溶剂（0.1%甲酸:乙腈=80:20，V/V）作为初始流动相条件，并采用梯度洗脱的方式，8 种药物可在5.5 min 内实现良好的分离，且能与基质中干扰组分有效分离，提高了方法的灵敏度。各药物的定量离子的提取离子色谱图如图2 所示。

图2 基质标准溶液中地西泮及其7 种代谢物质谱多反应监测（MRM）色谱图（0.3 μg/L）

2.2 样品净化条件优化

基于液-固相色谱理论的固相萃取技术，采用选择性吸附、洗脱方式，对样品进行富集、分离、净化，与传统的液液萃取法、蛋白沉淀法相比，固相萃取具有无可比拟的优势。从传统硅胶基填料到新型二乙烯基苯聚合物填料的发展，固相萃取已成为当前食品安全检测中样品净化的主要手段[7，14-17]。地西泮等苯二氮卓类药物含有多个N 原子，属碱性化合物，因此可使用具有阳离子交换特性的固相萃取柱净化该类药物[17-18]。

为获得更好的方法检测指标（重复性、变异系数、检测限、基质效应消除等），本研究专门对Waters、Agilent、CNW 等3 家公司以聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物为基质的3 种阳离子SPE 柱（分别简写为MCX-W、PCX、MCX-C），对8 种待测物的吸附保留特性进行了较为详细的比较。以酸化的尿液样品上样后，分别用不同体积分数的甲醇水溶液（0、20%、30%、50%、60%、70%、80%、100%）和5%氨化甲醇进行淋洗，制作淋洗曲线，然后对各药物在3 种SPE 柱上的保留特点进行考察。结果显示，8 种待测药物在3 种SPE 柱的保留特点有一定差别。Waters 公司的MCX-W 柱对待测药物的保留能力最弱，60%甲醇可将奥沙西泮药物洗脱，洗脱率为25.5%；70%甲醇还可将替马西泮洗脱，奥沙西泮和替马西泮的洗脱率分别为73.2%和87.8%，其他6 种药物均不能被洗脱。CNW 公司的MCX-C 柱和Agilent 公司的PCX 柱较前者的保留能力略强，60%甲醇不能将任何药物洗脱，70%甲醇溶液可将奥沙西泮、替马西泮洗脱，洗脱率为48.6%～53.2%，其他6 种药物均不能被洗脱。

为此，本研究进一步比较了CNW 公司的MCX-C 柱和Agilent 公司的PCX 柱对8 种药物的保留特性及基质效应，以水、60%甲醇水溶液作为淋洗液进行淋洗。结果发现：8 种药物在2种SPE 柱均可有效保留；而以5%氨化甲醇进行洗脱后，8 种药物的回收率均为75.0%～114.0%，均可满足兽药残留检测的需要。按照基质效应的计算方法[19-20]，以PCX 柱净化的基质效应为67.0%～135.0%，以MCX-C 柱净化的基质效应为35.0%～148.0%。因此，本研究选取Agilent 公司的PCX 柱作为净化柱，将尿液pH 调至酸性后上样，再依次用水、60%甲醇水溶液各3 mL 进行淋洗，最后用5%氨化甲醇洗脱待测物。

2.3 方法学考察

2.3.1 基质添加标准曲线、线性范围、相关系数、检测限和定量限 在上述最佳色谱-质谱条件下，将空白猪尿液样品按照1.3 中的方法进行处理。在洗脱液中加入一系列混合标准溶液制备基质匹配标准曲线，用UPLC-MS/MS 检测。以各药物的浓度与其定量离子峰面积进行线性回归，发现在0.3～20.0 μg/L 范围内呈现良好的线性关系（R2均大于0.995）。通过尿液添加回收试验，确定本方法测定猪尿液中地西泮及其7 种代谢物的检出限为0.1 μg/L，定量限为0.3 μg/L（表2）。

2.3.2 准确度和精密度检测 分别在猪尿液中以定量限、2 倍定量限、20 倍定量限等3 个水平（0.3、0.6 和6.0 μg/L）进行空白样品加标回收试验，考察方法的准确度/回收率（n=18）、日内变异系数（n=6）和日间变异系数（n=3）。以基质匹配标准曲线进行校正，结果发现，8 种药物的平均回收率为73.6%～95.3%，日内、日间相对标准偏差分别为2.9%～18.6%和2.2%～12.6%（表2）。

2.4 实际样品检测 以本方法对山东省某屠宰场抽取的45份猪尿液样品进行检测，未发现阳性样品。

表2 猪尿液中8 种药物的标准曲线、相关系数、平均回收率和日内、日间相对标准偏差

3 结论

本研究通过对不同阳离子交换固相萃取柱及淋洗、洗脱条件进行选择、优化，发现选取PCX柱进行净化可有效去除样品基质干扰，从而建立了UPLC-MS/MS 测定猪尿液中地西泮及其7 种代谢物残留的分析方法。该方法灵敏度高、重复性好，且操作简单、快速，可用于畜产品质量安全监测大批量样品中镇静剂类药物残留的筛查和确证。