我国部分地区禽戊型肝炎病毒分子流行病学分析

张 翔，林婷婷，刘丰波，宋姗姗，李 彬，栾栋祖，王群义，刘 平，刘红祥，马 冬，任衍倍，刘 东，3

（1.青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266000；2.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109；3.动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266000）

禽戊型肝炎病毒（avain hepatitis E virus，aHEV）属于肝炎病毒科正戊肝病毒属B 种，是一种无囊膜的单股正链RNA 病毒[1]，主要流行4 个基因型：澳大利亚和韩国的基因1 型，美国的基因2 型，中国和欧洲的基因3 型，匈牙利和中国台湾的基因4 型[2]。该病原引起的疾病最早可追溯到20 世纪80 年代澳大利亚、美国、加拿大等陆续报道的鸡大肝大脾病（big liver and spleen disease，BLS）或肝炎脾大综合征（hepatitis-splenomegaly，HS）[3-5]，2001 年确定病原并命名为禽戊型肝炎[6]。1994 年我国就有BLS 抗体阳性的报告，2010 年和2014 年分别从肉种鸡和蛋鸡群中分离到aHEV[7-8]。

aHEV 多感染产蛋期鸡群，病程为1～2 个月甚至更长，临床主要表现为死淘率升高（5%～15%）。剖检可见，肝脾肿大、出血，卵泡萎缩变形等，后期易继发细菌感染。为分析我国aHEV 基因变异情况，对2018 年从山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏等地疑似感染aHEV鸡群中采集的肝脏、脾脏病料样品进行aHEV RTPCR 检测，并对aHEV 阳性产物进行ORF1基因序列测定与遗传进化分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2018 年采集山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏9 个省份疑似aHEV 感染的鸡肝脏、脾脏样品共计679 份，无菌处理后，置于-20 ℃保存备用。

1.1.2 试剂 RNAout 提取试剂盒，购自天恩泽生物公司；HiScript®II One Step RT-PCR Kit，购自诺唯赞生物公司；DL 2 000 DNA Marker，购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参照GenBank 已公布的aHEVORF1基因核苷酸序列，利用Oligo 6.0 软件设计扩增aHEV-ORF1基因的特异性引物（aHEV-ORF1-F：5'-FCGTCTCGCAGATAGCAGAGTCC-3'；aHEVORF1-R：5'-TATAGCCCATTCCCGCTCAATC-3'）。引物由北京华大基因科技有限公司合成，预期扩增目的片段为750 bp。

1.2.2 病毒核酸提取 组织RNA 和DNA 提取，按核酸提取试剂盒和核酸提取仪说明书进行操作。

1.2.3 核酸扩增 用RT-PCR 一步法试剂盒扩增cDNA：45 ℃反转录30 min；94 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存10 min。PCR 产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，置于凝胶成像系统中观察结果。

1.2.4ORF1基因序列分析 挑取阳性样品产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。用MegAlign 和Mega6.0 软件，对测定的aHEVORF1基因序列与GenBank 中部分代表性毒株序列进行同源性比较和遗传进化分析。

2 结果

2.1 RT-PCR 检测

对送检的679 份样品处理后进行RT-PCR 检测，其中37 份样品扩增出750 bp 左右的目的片段（图1），为aHEV 阳性。将测序结果与GenBank比对，结果均为aHEV。

2.2 ORF1 基因同源性分析

图1 部分样品的RT-PCR 检测结果

从不同地区RT-PCR 阳性样品中，随机选取15 个试验毒株ORF1核苷酸序列，利用MegAlign进行同源性比较。结果（图2）显示：试验株之间ORF1基因同源性为90.1%～100%，而与基因1 型的澳大利亚株和韩国株同源性为 85.5%～89.0%，与基因2 型的美国原型株和美国无毒株同源性为85.5%～88.2%，与基因3 型的欧洲株和中国株同源性为 86.3%～89.7%，与基因4 型的匈牙利株和中国台湾株同源性为 86.4%～88.5%。

2.3 ORF1 基因遗传进化分析

利用Mega6.0 对15 株试验株的ORF1基因进行序列比较，绘制遗传进化树。结果（图3）显示：15 株aHEV 均属于戊型肝炎B 种，形成独立的基因分支，但不属于已报道的4 个基因型（基因1～4 型）。

3 讨论

目前国内外都对aHEV 进行了血清学和分子流行病学调查研究。我国南方鸡群aHEV 血清阳性率约为33%[9]，广东、山东、黑龙江3 个省份的鸡群血清阳性率约为28.3%[10]。这些血清学调查结果均显示，aHEV 已在我国鸡群中广泛流行。但血清学调查只能反映鸡群的抗体水平，无法检测鸡群的病原感染情况，且病毒分离难度较大；而分子生物学方法操作简单、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好，已被广泛应用于临床检测。ORF1基因编码aHEV 的多聚蛋白，包含甲基转移化酶、解螺旋酶以及RNA 依赖的RNA 聚合酶[2]。它们是目前国内外aHEV 的主要分型依据。

本研究通过RT-PCR 方法，对2018 年山东、河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山西、江苏等地区疑似aHEV 感染鸡群的679 份肝脏和脾脏病料样品进行aHEV 检测，结果检出37 份阳性样品，阳性检出率为5.45%，说明我国鸡群存在不同程度的aHEV感染，这应引起养鸡企业的高度重视。

图2 aHEV-ORF1 基因部分序列同源性分析结果

图3 aHEV-ORF1 基因遗传进化树

通过对15 株aHEV 野毒株的ORF1基因进行测序分析，发现所检出毒株均属于B 种，但不属于现已报道的4 个基因型，为新亚型。通过核苷酸同源性比对分析发现，15 株aHEV 野毒株与基因1～4 型的代表株同源性均低于90%，而15 株分离株之间的差异不大，同源性为90.1～100%。目前关于aHEV 新亚型的相关报道较少，本研究为我国aHEV 的分子流行病学分析提供了补充和参考。