基于网络药理学探讨“桂枝-附子”温通经脉配伍治疗类风湿关节炎的作用机制Δ

黄 菁，汪宗清，陈 晨，汤小虎

(1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210000； 2.昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院中西医结合科，云南 昆明 650118； 3.云南中医药大学第一临床医学院，云南 昆明 650000； 4.云南中医药大学第一附属医院风湿科，云南 昆明 650000)

桂枝为樟科植物肉桂的干燥嫩枝，具有发汗解表、温通经脉和通阳化气的功效。在温通经脉方面，《神农本草经》谓之“利关节”“为诸药先聘通使”；《本草思辨录》中总结，“桂枝所优，在温经通脉，内外证咸宜”，皆说明桂枝具有温通经脉之效[1]。现代药理研究结果表明，桂枝具有扩血管[2]、解热[3]、镇痛抗炎[4]、镇静和抗惊厥[5]、抗过敏[6]、抗菌[7]以及抗病毒[8]等作用。

附子为毛茛科植物乌头的侧根。附子始见于《神农本草经》，被列为“下品”。附子具有回阳救逆、助阳补火、散寒止痛和祛风散邪的功效。在散寒止痛方面，《神农本草经》记载，附子“治痿躄，拘挛，膝痛不能步行”。附子既能散寒除湿，又能祛风，为蠲痹之要药，如《本经逢原》记载，“附子气味俱厚而辛烈，能通行十二经，无所不至”。现代药理研究结果表明，附子具有强心[9]、扩血管[10]、抗休克、抗心律失常[11]和心肌保护作用[12]。

桂枝性温味辛，辛则发散，温则能通，散在表之风寒湿邪而宣通痹痛，善治各种痹阻于肌肉经络骨节的疼痛。附子性大热，味辛、甘，其用走而不守，通行十二经。桂枝、附子两药相须为用，强于温散，脏腑经络和四肢百骸之风寒湿邪均可温散除之。中药是多成分、多靶点及多种成分间协同作用的复杂体系。网络药理学是以中医整体观为指导的中药研究方法，遵循系统论和还原论相结合、宏观和微观相结合的方法，以系统生物学和网络生物学为主要技术支撑，结合现代药理学研究成果，对中药进行多层次系统研究，全面揭示中药多成分、多靶点、多通路的整体协同作用，这与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)发病与遗传、环境及激素等多因素交互作用的复杂发病机制相契合。本研究基于网络药理学方法，探讨了“桂枝-附子”温通经脉配伍治疗RA的作用机制。

1 资料与方法

1.1 化学成分的构建与筛选

基于中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php),分别检索桂枝(Cinnamomi Ramulus)、附子(Aconiti Lateralis Radix Praeparata)的所有化学成分。

1.2 中药成分靶点获取

基于TCMSP，分别检索桂枝和附子的全部靶点。

1.3 疾病靶点获取

在GeneCards数据库，以“Rheumatoid arthritis”为检索词进行检索。

1.4 获取药物靶点和疾病靶点交集

利用Bioinformatics & Evolutionary Genomics 线上软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，构建化合物与疾病交集靶点韦恩图。

1.5 构建“桂枝附子配伍-化学成分-靶点-RA”网络

基于“桂枝-附子”化学成分信息、化学成分与RA交集靶点信息以及二者的对应关系，利用Cytoscape 3.6.0 软件，绘制“桂枝附子配伍-化学成分-靶点-RA”网络图。

1.6 构建药物靶点-疾病靶点间蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络

使用STRING 11.0在线软件，构建“化学成分-疾病”的PPI网络，挖掘该调控网络的核心靶点。

1.7 基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的通路富集分析

采用David Bioinformatics Resources 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，对“桂枝-附子”温通经脉配伍活性成分潜在靶点网络中的蛋白进行GO功能富集分析和基于KEGG的生物通路富集分析。

2 结果

2.1 筛选化合物基本信息

基于TCMSP检索到桂枝的化学成分220个，附子的化学成分65个。按口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和类药性(drug-likeness, DL)≥0.18作为化学成分筛选条件，得到桂枝7个化学成分，附子21个化学成分，见表1。

2.2 中药成分靶点信息

基于TCMSP检索得到桂枝的化学成分靶点2 402个，附子化学成分靶点139个。

2.3 疾病靶点信息

检索得到RA疾病靶点920个，其中相关度>50的疾病靶点见表2。

2.4 化合物靶点和疾病靶点交集信息

化合物与疾病交集靶点韦恩图见图1，得到交集靶点16个，靶点信息见表3。

2.5 构建“桂枝附子配伍-化学成分-靶点-RA”网络

“桂枝附子配伍-化学成分-靶点-RA”网络图见图2。

2.6 构建PPI网络

“化学成分-疾病”的PPI网络见图3；该调控网络的核心靶点和节点度值见表4。

2.7 GO富集分析和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析结果见图4；KEGG通路富集分析结果见表5、图5。

表1 桂枝-附子配伍化合物基本信息

表2 相关度>50的疾病靶点

图1 化合物与疾病交集靶点韦恩图

表3 化合物与疾病交集靶点名称

图2 “桂枝附子配伍-化学成分-靶点-RA”网络图

3 讨论

桂枝辛温发散，其入药部位为枝条，可通达四肢，温通经脉，宣通痹痛。配伍附子相须为用，则可增强桂枝温散之力。《本草备要》总结了附子的功效，其“逐风寒湿。辛甘有毒、大热纯阳，其性浮而不沉、其用走而不守，通行十二经，无所不至。同桂枝温经散寒”，附子温通内外，温达脏腑经络、四肢百骸，凡入侵机体的风寒湿邪，痹阻四肢经络骨节，出现疼痛、麻木及

图3 “化学成分-疾病”PPI网络图

表4 “化学成分-疾病”PPI网络的核心靶点和节点度值

表5 KEGG富集结果

关节屈伸不利之症，均可应用“桂枝-附子”这一配伍结构施治取效[1]。本研究按照网络药理学研究思路，在TCMSP分别检索桂枝和附子的化学成分，按OB≥30%和DL≥0.18筛选、去重后得到27个化学成分。再次基于TCMSP分别检索桂枝和附子化学成分靶点，去重后得到桂枝的化合物靶点660个，附子的化合物靶点7个，合计667个靶点，两药的交集靶点61个，体现出桂枝-附子配伍具有多靶点作用且共享多个靶点的特征，也体现出二者相须为用的特点。通过构建“桂枝-附子”配伍的化合物靶点与疾病靶点的交集(见图1)，发现化合物与疾病靶点聚焦在16个基因上：SLC6A4、CHEK1、BCL2、ICAM1、CASP8、CA2、PGR、CASP9、CAT、PTGS2、CHRM3、PTGS1、JUN、BAX、CASP3及HSP90AA1(见表3)。其中，BCL2通过诱导(促凋亡)或抑制(抗细胞凋亡)来调节细胞死亡(细胞凋亡)。BAX与BCL2形成异二聚体，起到凋亡激活剂的作用。BAX与BCL2的关联和比例也决定了细胞凋亡后细胞的存活或死亡。BCL2的表达受肿瘤抑制基因p53调控，并已显示出与p53介导的细胞凋亡有关。ICAM1编码内皮细胞和免疫系统细胞上表达的细胞表面糖蛋白，与CD11a/CD18或CD11b/CD18类型的整合素结合。CASP8、CASP9及CASP3编码的蛋白质是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在细胞凋亡的执行阶段起着关键作用，通过参与Fas和各种凋亡刺激诱导的程序性细胞死亡。CA2编码的蛋白质可催化二氧化碳的可逆水合。该酶的缺陷与骨质疏松和肾小管酸中毒有关。CAT编码过氧化氢酶，是机体抵抗氧化应激的关键抗氧化剂。过氧化氢酶将活性过氧化氢转化为水和氧气，从而减轻了过氧化氢的毒性作用。氧化应激被认为在许多慢性或迟发性疾病的发展中起着作用，如哮喘、系统性红斑狼疮、风湿性关节炎和恶性肿瘤[13]。CAT的多态性与过氧化氢酶活性的降低有关[14]。PTGS1、PTGS2是前列腺素生物合成中的关键酶，涉及炎症和有丝分裂的前列腺素类生物合成[15]。

利用Cytoscape 3.6.0软件构建的“桂枝附子配伍-化学成分-靶点-RA”网络，通过网络分析，计算出度值较高的化合物/靶点，依次为：MOL000358(beta-sitosterol，β-谷甾醇)，度值为13；PTGS2，度值为10；PTGS1，度值为9；HSP90AA1，度值为7；MOL004576(taxifolin，二氢槲皮素)、MOL000492[(+)-catechin，儿茶素]、MOL002388(Delphin_qt，石防风素)及PGR，度值均为5。

图4 GO功能富集分析结果

图5 KEGG通路富集分析结果

在PPI网络中，有16个节点，代表16个靶基因；47条边，代表靶基因间47条关联；PPI富集度P值为1.33×10-15；平均节点度值为5.88。采用David Bioinformatics Resources 6.8数据库对“桂枝-附子”温通经脉配伍活性成分潜在靶点网络中的蛋白进行GO功能富集分析，结果显示，该配伍主要影响半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程、过氧化物酶活性、作用于过氧化物的氧化还原酶活性、BH域结合、死亡域结合、抗氧化活性、死亡受体结合、泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、半胱氨酸型内肽酶活性、血红素结合、四吡咯结合、半胱氨酸型肽酶活性、肿瘤坏死因子受体超家族结合、神经递质结合、支架蛋白结合、铵离子结合、双加氧酶活性、蛋白酶结合及内肽酶活性过程。

基于KEGG生物通路富集分析进行通路富集，结果显示，富集程度较高的前15条通路依次为：癌症通路、乙型肝炎、肌萎缩性侧索硬化症、凋亡、结直肠癌、p53信号通路、TNF信号通路、结核、病毒致癌、病毒性心肌炎、弓形虫病、5-羟色胺能突触、非酒精性脂肪性肝病、亨廷顿舞蹈病、HTLV-I 感染。说明“桂枝-附子”温通经脉配伍的多通路、多途径作用潜在影响了RA的信号转导和疾病进程。在TNF信号通路中，桂枝-附子温通经脉配伍可能通过上调CASP8进一步上调CASP3而促进细胞凋亡，同时影响AP-1的表达而干扰DNA上调细胞间信号、影响转录因子JUN的表达、促进细胞黏附和炎症介质的合成。本研究从网络药理学角度预测了“桂枝-附子”温通经脉配伍治疗RA可能的信号通路，为后续机制研究奠定了一定的基础。